明场显微镜对于许多透明生物标本通常只能提供低对比度图像，无法区分很多细节。 提高明场显微镜对比度的一种方法是使用选择性染色剂，但这种染色剂通常对活细胞有毒。 使用相差光学显微镜，无需染色就可以更大对比度观察各种类型生物标本的结构。 相差方法利用样本结构之间的光密度差异，使光与样本及其结构相互作用后发生相位变化。

徕卡显微镜为各种生命科学和法医学应用中的细胞或组织研究提供相差方法。 相差方法在某些材料科学和地球科学应用中也非常有用。

什么是相差？

相差显微镜有哪些用途？ 这类显微镜可以将哪些类型的样本可视化？

相差显微镜如何工作？

相差显微镜类似于传统的宽场显微镜，不同之处在于它使用环形光圈和四分之一波片（λ/4）相位板。 环形光圈位于光源和聚光镜之间，相位板位于物镜后面的显微镜光学器件中。 环形光穿过光圈，被聚光镜聚焦到待观察的生物标本上。

部分环形光被样本的光密结构衍射，发生约λ/4的负相位差。 发生相位差的衍射光绕过四分之一波片。 与此不同，另一部分环形光直接穿过样本，不发生偏离，到达相位板后发生λ/4正相位差。 被样本结构衍射的光与穿过相位板的光之间的总相位差约为λ/2，因此会发生相消干涉。 因此，光密度高的细胞结构看起来就会比光密度低的结构更暗。

更多信息请参考以下文章：https://www.leica-microsystems.com/science-lab/phase-contrast

立体显微镜 - 照明

徕卡显微系统的LED照明为各种入射光应用提供了冷调、自然的色光。与传统的卤素灯相比，LED技术耗电更低，持续时间更长，从而节省了能源和金钱。如果你正在寻找均匀、高对比度、同轴、高度分散，或几乎无阴影的照明系统，徕卡为您的应用和任务提供广谱LED照明灯。

LED的好处

LED技术提供了一个很好的显微镜的巨大利益，也有许多优点。

明亮，均匀的照明

环形灯照明最适合于明亮，均匀的照明。

Leica LED3000 RL, Leica LED5000 RL

高对比度光照

高对比度照明提供高灵活性，可移动的鹅颈聚光灯照明。固定多对比照明提供了相同的结果，但他们的设计使得重复性的照明设置。

聚光灯照明: Leica LED3000 SLI, Leica LED5000 SLI

多对比照明: Leica LED3000 MCI, Leica LED5000 MCI

同轴照明

同轴照明，光束通过光学系统的指导和对样本中反映出来。这要求样品是光滑的反光。同轴照明可以用常规以及高性能的立体显微镜。

Leica LED5000 CXI

高度分散的照明

闪亮的样品往往是非常困难记录为文件。下或曝光过度区域收购数码显微镜摄像头，并不能得到进一步的评估。为了改善这个问题，一个特殊的圆顶照明开发与徕卡FlexDome™。

Leica LED5000 HDI

近无阴影照明

影无照明使用被称为“近垂直照明。”在这里，有两个 LED射灯是非常接近的光轴和样品上大放异彩。

Leica LED3000 NV

显微镜分辨率：概念、因素和计算

艾里斑、阿贝衍射极限和瑞利判据

在显微镜学中，‘分辨率’一词用于阐述显微镜对细节进行区分的能力。换言之，这是样本内两个能被观察人员或者显微镜摄像头区分的实体点之间的最小距离。

显微镜的分辨率本质上与光学元件的数值孔径（NA）以及用于观察样本标本的光波长有关。此外，我们必须考虑Ernst Abbe于1873年首次提出的衍射极限。

本文章包含了这些概念的历史介绍并使用相对简单的术语对其进行了解释。

分辨率与数值孔径

数值孔径（NA）与光通过的介质的折射率（n）以及给定物镜的孔径角（α）有关（NA=n × sin α）。显微镜的分辨率不仅取决于物镜的NA，还取决于整个系统的NA，要把显微镜聚光镜的NA也纳入考虑。在显微镜系统中，所有光学元件都正确对齐、具有相对较高的NA值并且相互协调工作，可以分辨出更多的图像细节。分辨率还与标本成像所用的光波长有关；波长越短，可分辨的细节越多，波长越长则分辨细节越少。

在处理分辨率时需要考虑三个数学概念：‘阿贝衍射极限’、‘艾里斑’和‘瑞利判据’。以下按时间顺序逐一介绍。

George Biddell Airy（1801-1892）是英国数学家和天文学家。1826年，25岁的他被任命为三一学院的数学教授，两年后，被任命为新剑桥天文台的天文学教授。1835年到1881年期间，他是“皇家天文学家”，月球和火星上各有一处以他的名字命名的陨石坑。

1835年，他在剑桥哲学学会学报上发表了一篇题为《有关圆孔径物镜的衍射》的论文。Airy在论文中以一个天文学家的视角描述了通过一个精良的望远镜观察到的恒星周围的光环或者射线的形状及亮度。尽管是从不同的科学领域发表的文章，但这些观察结果与其他光学系统，特别是显微镜存在着关联

艾里斑(Airy Disc)是在衍射限制的系统中由圆形孔径形成的聚焦的光点。如图图1所示，其呈现为中央亮点和周围是明暗相间的同心环（更准确地说，这是艾里图案Airy pattern）。

衍射图案由光的波长和光所通过的孔径大小决定。艾里斑的中心点含有大约84%的光强，其余16%分布于环绕该点的衍射图案中。当然，用显微镜进行观察时标本上会有许多光点，因此基于大量的艾里图案来考虑，而非如“艾里斑”描述的单个光点来考虑是更妥当的方式。

图1右所示的艾里图案三维表示又称为‘点扩散函数’。

Ernst Karl Abbe（1840-1905）是一位德国数学家和物理学家。他与Carl Zeiss共同创立了“蔡司光学工作室”即现在的蔡司公司。除此之外，他还在1884年联合创办了Schott Glassworks。Abbe还是定义数值孔径这一术语的首位学者。1873年，Abbe发表了自己的理论和公式对显微镜的衍射极限进行了解释。Abbe发现，标本图像由许多重叠的、多强度且存在衍射极限的点（或艾里斑）所组成。

要提高分辨率（d=λ/2 NA），标本必须使用波长（λ）更短的光来进行观察，或者通过折射率相对高的成像介质来进行观察，又或者使用NA较高的光学组件来进行观察（或者将全部3种因素组合起来）。

但即便将所有这些因素都考虑在内，显微镜系统的极限依然受到限制，因为系统复杂性，波长低于400 nm的光在玻璃中的传播特征，以及整套显微镜需要达到较高的NA。理想光学显微镜的横向分辨率限制在200 nm左右，而轴向分辨率约为500 nm（有关分辨率极限示例，请参见下文）。

第三代瑞利男爵John William Strutt（1842-1919）是一名英国物理学家，也是一位高产学者。他一生编写了多达466篇论文，包括430 篇科研论文。他的论文涉猎极广，各种主题都有，如鸟类飞行、心理研究、声学等等。1895年，他发现了氩并凭借这一发现于1904年获得诺贝尔奖。

Rayleigh以George Airy的理论为基础上并进一步延伸，于1896年创造了“瑞利判据”理论(Rayleigh Criterion)。瑞利判据（图2）在衍射极限系统当中定义了分辨率极限，换言之，就是何时能够将2个光点相互区分或分辨。

使用艾里斑理论，如果2个单独艾里斑的衍射图案不重叠，则就可以轻松区分、‘分辨’两者并认定满足瑞利判据（图2，左图）。而当艾里斑的中心直接重叠于另一个艾里斑的第一最小衍射图案时，则两者认定为‘刚好分辨’，同时依然可以区分为2个独立的光点（图2，中图）。如果艾里斑再继续相互接近，则两者无法满足瑞利判据，因此“无法被分辨”为2个不同的光点（或者标本图像中的单独细节；图2，右图）。

将以上全部理论都考虑在内就可以明显看出，在计算分辨率的理论极限时需要考虑很多因素。分辨率还取决于样本性质。我们来看一下使用阿贝衍射极限以及使用瑞利判据进行的分辨率计算。

首先应当要牢记：

NA= n x sin α

式中n为成像介质的折射率，α是物镜孔径角的一半。物镜的最大孔径角大约为144º。该角度一半的正弦为0.95。如果使用油浸物镜且折射率为1.52，则物镜的最大NA为1.45。如果使用‘干式’（无浸没）物镜，则物镜最大NA为0.95（因为空气的折射率为1.0）。

横向（即XY）分辨率的阿贝衍射公式为：

d= λ/2 NA

式中λ 是标本成像所用的光波长。如果使用514 nm的绿光及NA为1.45的油浸物镜，则分辨率的（理论）极限将达到177 nm。

轴向（即Z）分辨率的阿贝衍射公式为：

d= 2 λ/NA2

同样的，如果我们假设通过波长514 nm的光来观察标本且物镜NA数值为1.45，则轴向分辨率为488 nm。

在阿贝衍射极限的基础上，瑞利判据稍稍得到了细化：

R= 1.22 λ/NAobj+NAcond

式中λ为标本成像用的光波长。NAobj 为物镜NA。NAcond为聚光镜NA。‘1.22’是一个常系数。该数值根据Rayleigh的贝塞尔函数研究推导得出。这些主要用于对系统当中的问题，例如波的传递，进行计算。

将聚光镜的NA考虑在内，空气（折射率为1.0）通常是聚光镜和玻片之前的成像介质。假设聚光镜的孔径角为144º，则NAcond数值将等于0.95。

如果使用514 nm的绿光，油浸物镜的NA为1.45，聚光镜的NA为0.95，则分辨率的（理论）极限将达到261 nm。

如上所述，用于对标本成像的光波长越短，可以分辨的细节越多。因此如果使用400 nm的最短可见光波长，油浸物镜NA为1.45，聚光镜NA为0.95，则R等于203 nm。

要在显微镜系统当中达到（理论）分辨率的最大值，每个光学组件都应当具备最高可用的NA（把孔径角纳入考虑）。此外，观察标本所用的光波长越短则分辨率越高。最后，整个显微镜系统都应当准直对齐。

但是市面上的盖玻片耗材多种多样，厚薄不一（见表1）。除此之外，在倒置显微镜上，经常会使用诸如培养皿、多孔板等各种不同类型的耗材，有些器皿的底部厚度甚至达到了1-2mm。此时，必须使用带有校正环功能的物镜来进行成像。

表1、MatTek公司不同号码盖玻片及其对应的实际厚度

在倒置显微镜中，经常需要配置长工作距离物镜，因为长工作距离物镜不仅能用于载玻片观察，还能兼容不同底部厚度的器皿，进行活细胞观察。在长工作距离物镜上，我们经常会发现有一圈能左右转动的校正环（图1）。针对不同厚度的耗材，我们需要将校正环调节到不同位置。

图1、带校正环的20倍和63倍物镜。英文简写CORR代表此物镜带有校环，校正环可以左右转动，将环上的小点位置调节至当前使用盖玻片或器皿底部的厚度处。

别小看了这个校正环，它对显微成像会产生很大的影响。我们使用0.17mm盖玻片的样品进行了相应测试。明场成像时，如果校正环调节位置不对，成像清晰度会严重下降，而且是无法通过镜体调焦旋钮来改善的（图2）。在对荧光成像时，校正环设置不准确，除了清晰度下降以外，荧光的亮度也会发生大幅下降（图3）。因此，大家在倒置显微镜上观察时，记得要确认一下物镜是否带有校正环，校正环的位置调节是否正确。

图2、肾脏病理切片的明场成像。成像物镜为带校正环的40倍物镜，校正环位置分别为0（左上），0.17（右上），1.0（左下），2.0mm（右下）。

图3、Mito-TrackerRed标记的线粒体荧光成像。成像物镜为带校正环的63倍物镜，校正环位置分别为0.3（上），0. 7（中），0.17 mm（下）。

但是，倒置显微镜在物镜转盘处的操作空间狭小，对于手指粗壮的男同胞来说，伸手进去调节校正环稍显麻烦。特别是在搭载了双荧光光路和孵育箱的活细胞工作站上（图4），手动调节校正环会变得更加吃力。

图4、搭载双荧光光路的DMi8活细胞工作站（上图配置的为培养小室，下图配置的为大型孵育箱）

一直以来，徕卡将人性化设计贯穿于所有产品之中。针对倒置显微镜物镜转盘处操作空间狭小，手动调节校正环困难的问题，徕卡推出了独家设计的motCORR物镜，可通过外部旋钮和LAS X成像软件，即可对物镜校正环进行全电动调节（图5）。

图5、徕卡motCORR物镜（左），可通过外部旋钮（右下）和LAS X成像软件（右上）进行物镜校正环全电动调节。

尤其是在一些高端成像方式中，经常需要对物镜的校正环进行调节（图6）。motCORR能提供比手动调节更可靠的参数设置，而且更具有可重复性。

图6、徕卡motCORR物镜非常适用的三大应用方向：FCS（左）、多光子（中）和活细胞（右）成像。

如在FCS（Fluorescence Correlation Spectroscopy，荧光相关光谱）成像时，通过motCORR可轻松将共聚焦激发体积调节接近至数学模型，从而得出更加准确的FCS分析结果。其次，在做活体厚组织红外多光子成像时，由于组织内部的折射率不均一，会导致结构扭曲，荧光亮度大幅下降，通过motCORR对样品折射率的校正，以获得亮度和对比度更高的组织深部荧光图像，达到更大的穿透深度。此外，motCORR可与高数值孔径的水镜、水镜自动加水微泵和AFC（adaptivefocus control）自适应稳焦系统全面兼容，轻松实现完美活细胞成像。

来源：徕卡显微系统

使用LIBS通过目视和化学分析进行有效颗粒识别

在制药行业，从初始研发到最终产品的包装都可能出现颗粒污染。

理解颗粒成分并判断其对安全性和质量的潜在影响非常重要。对于污染源的识别，常用的化学颗粒分析方法较为复杂且耗时。

激光诱导击穿光谱（LIBS）能够同时进行目视和化学分析。DM6 M LIBS二合一解决方案可以快速识别颗粒。

• 在同一系统中进行操作

• 在1个工作流程步骤内发生

• 无需额外样本制备

• 无需将样本转移至其他分析器械

塑料、玻璃和金属颗粒可以通过其目视外观和光谱指纹进行区分。LIBS甚至可以进一步区分不同类型的金属和玻璃，并且可以大致识别有机材料。

来源：徕卡显微系统微信公众号

SO 16232标准和VDA 19指南对汽车行业制造过程的重要性

本文讨论了ISO 16232标准和VDA 19指南，并简要总结了颗粒物分析方法。它们为汽车零部件在微粒污染方面的清洁度提供了重要标准。此类颗粒物会对产品性能和寿命产生影响。在清洁度分析中，可以使用自动光学显微镜方法来确定颗粒物类型、大小和造成损坏的可能性。有时，需要更多成分信息，才能准确找到潜在的损害和污染源。这时候就需要借助激光光谱（LIBS）或电子显微镜。

标准化方法可以帮助零部件供应商和产品制造商获得可再现、可靠和可比较的清洁度。汽车和运输行业的主要标准是ISO 16232[1]和VDA 19[2,3]。供应商和制造商在清洁度分析中需要参考标准中常见参数的定义和值范围，例如颗粒物尺寸和成分、颗粒物识别的阈值、图像设置等。汽车行业中用于清洁度分析的颗粒物检测和计数通常符合ISO标准和VDA指南。本文简要概述了ISO 16232和VDA 19中提到的颗粒物分析方法。

对于汽车行业，ISO 16232标准定义了用于确定污染物颗粒大小和数量的方法[1]。从汽车零部件中提取这些颗粒物时，使用液体清洗，并用膜过滤器过滤液体，随后收集表面上的颗粒物。然后使用光学显微镜（手动或使用自动系统）和图像分析技术分析颗粒物[4-6]。最后便可获得粒径分布。
VDA 19指南补充了ISO 16232标准[2,3]。VDA 19更详细地说明：适用范围和有效性、清洁度检查、监测变化、检查方法的选择、测试组件的适当清洁处理、提取程序设置、验证、以及空白测试以及案例研究[2]。此处仅提及VDA 19.1和技术清洁度检查。

通常使用光学系统对滤膜进行全自动分析来验证清洁度。颗粒物检测、测量和分类很大程度上取决于镜头（即放大率和分辨率）、照明类型（例如偏振、明场或暗场）、图像处理软件中使用的阈值以及颗粒物特性（尺寸、成分、反射率等）。因此，在比较相同类型颗粒的结果时，光学系统和分析参数必须相同。
标准光学分析
为了提供有意义的比较，建议进行标准光学分析。标准光学分析中，在确定规范之前定义图像设置和分析过程，因此与使用的系统无关。
颗粒物的检测和测量
测量的精度主要由显微镜镜头的放大倍率和分辨率决定。更高的放大倍率可以提高精度，但也会降低景深。因此，当在高放大倍率下测量小颗粒时，垂直方向的电动平台系统可以补偿低景深和过滤器表面的不规则性。使用高放大倍率还需要分析大量图像，以便全面检查滤光片。因此，必须在测量精度和处理/分析时间之间找到平衡点。
此外，为了准确地确定尺寸和范围，颗粒应均匀分布在过滤器表面上而没有重叠，并以颗粒物所占的表面百分比来报告。
偏光片
交叉偏振器可用于消除金属颗粒的反射，在这种情况下，金属颗粒在明亮的背景上会显得很暗。如果不使用偏光片，当亮区的亮度与背景滤光片的亮度相似时，就有可能将亮区和暗区的颗粒分成几个颗粒。不使用偏光片时，非常接近的颗粒也可能会出现大小和形状的变形，因为当它们靠近在一起时，相邻的颗粒可能看起来很相似，类似于一个更大的颗粒。
颗粒长度和宽度
颗粒的大小和特征可以通过标准分析来确定。颗粒长度，即2条平行线之间的最大距离，Feretmax，其可以应对于2个敏感元件[5]之间的距离，例如电引线，这意味着颗粒能够“连接”它们。宽度或Feretmin是2条平行线[5,6]之间的最小距离，当它对应的通道宽度足以使颗粒通过时，则表示存在潜在的危险。
纤维
纤维在制造过程中也是一个常见问题，但纺织纤维（例如来自服装的纤维）的潜在破坏性弱于纤维状颗粒物，因此应将这些类型相互区分开来。通常，细长长度与最大内径之比大于20且内径小于50 µm的颗粒会被认为是纤维。
金属颗粒
金属颗粒是组件上最常见的污染物之一，由于其机械和电气特性，它们对许多应用具有高危害性。由于光学外观的变化，基本标准光学方法无法可靠地识别金属颗粒，需要使用扩展分析方法。
然而，可以使用非偏振光学系统进行第一次表征，通过其闪亮外观（直方图强度值接近白色的强度值的反射）识别金属颗粒。可以执行自动分析以确定闪亮颗粒是否为金属，但只有在系统参数（镜头类型、放大倍率、其他参数设置等）和颗粒特征（颜色、粗糙度、均匀性等）相同时才能比较结果。如果满足以下两个要求，则可以使用此方法：
通过已使用的参数设置确定颗粒具有金属光泽，但可能需要事先进行扩展分析加以证明
由专业的操作员目视确认自动表征结果
材料和设备
颗粒分析需要以下材料和设备：

• 显微镜
  无伪影均匀光源发出的入射（反射）光
  滤光片必须紧紧固定在样品架上，最好用玻璃盖压平，以确保整个滤光片可以在特定放大倍率下成像
  过滤器的定位使用电动装置完成，精确性应可以观察到最小颗粒
  镜头分辨率和相机传感器的像素数应匹配，以便可以应用10 像素标准，即最小颗粒尺寸应对应于至少10个像素（参见图1）

当需要有关形状、成分、来源、物理特性（硬度、磨损性等）或颗粒造成损坏的可能性等额外或更详细信息时，可以使用扩展分析方法。使用扩展分析可以更确定地识别金属颗粒。
颗粒高度
显微镜镜头的景深(T)可用于估计颗粒的高度(H)。T值随着镜头数值孔径(NA)而减小，因此，在更高的放大倍率和分辨率下会减小。使用以下等式计算：T = 550/(NA)2.H值可以根据颗粒顶部和底部的焦平面之间的垂直差或透镜沿Z轴的运动来确定[5,6]。应记录所有测量的颗粒高度，因为这些数据以及宽度和长度可用于确定潜在的损坏。
成分分析
单个颗粒的成分可以通过使用激光诱导击穿光谱（LIBS）或能量色散X射线光谱（EDS/EDX）进行直接元素分析来获得。LIBS中使用激光脉冲撞击颗粒，形成局部等离子体并发射特定波长的光[7]。然后使用光谱数据库来识别颗粒元素成分。使用扫描电子显微镜（SEM）执行EDS。

市场需要这样一种解决方案：它不仅能使用户满足ISO 16232标准和VDA 19.1指南的颗粒分析要求，同时还可以减少耗费的时间和精力。利用清洁度分析解决方案，用户可以根据ISO 16232和VDA 19的当前要求以及未来可能的更新来分析颗粒。
了解颗粒成分有助于可靠地确定颗粒造成损害的可能性并确定污染源[1,2]。使用二合一材料分析解决方案，结合光学显微镜和LIBS[6,7]，可以有效地执行颗粒的成分分析。目视检查过滤器上的颗粒，然后立即使用LIBS[6]进行化学分析，无需将过滤器转移到另一台仪器或开展额外的样品制备

1. ISO/DIS 16232:2018, Road Vehicles - Cleanliness of components and systems, International Organization for Standardization.

2. VDA (German Association of the Automotive Industry), QMC (Quality Management Center), Volume 19, Part 1, Inspection of Technical Cleanliness, Particulate Contamination of Functionally Relevant Automotive Components, 2nd Revised Edition, March 2015.

3. VDA (German Association of the Automotive Industry), QMC (Quality Management Center), Volume 19, Part 2, Technical cleanliness in assembly, Environment, Logistics, Personnel and Assembly Equipment, 1st edition 2010.

4. Y. Holzapfel, J. DeRose, G. Kreck, M. Rochowicz, Cleanliness Analysis in Relation to Particulate Contamination: Microscopy based measurement systems for automated particle analysis, Science Lab (2014) Leica Microsystems.

5. N. Ecke, Basics in Component Cleanliness Analysis, Science Lab (2017) Leica Microsystems.

6. J. DeRose, K. Scheffler, D.R. Barbero, Key Factors for Efficient Cleanliness Analysis, Science Lab (2020) Leica Microsystems.

7. K. Scheffler, See the Structure with Microscopy - Know the Composition with Laser Spectroscopy: Rapid, Complete Materials Analysis with a 2-Methods-In-1 Solution, Science Lab (2018) Leica Microsystems.

汽车工业现在会通过一系列装饰或功能性处理改善车身表面。然而，用于检测多层样本的传统质控方法不仅耗时，而且还会漏检缺陷。结定位表面研磨系统和光学显微镜的新方法有望提高检测的速度和可靠性。

安美特西班牙实验室经理F. Javier Ruiz Balbas讲述了自己使用这一系统的体验。安美特是一家全球领先的供应商，专为印刷电路板、先进包装和半导体制造以及装饰性和功能性表面处理提供特种化学药品、设备、服务和解决方案。

您能简单介绍下质控部门的工作流程吗？

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您公司的质控部门有哪些独特的优势呢？

在使用徕卡EM TXP/DM2700 M系统之前，工作流程是怎样的？有哪些不足之处？

您在日常工作中已经积累了一些操作徕卡EM TXP/DM2700 M的经验，那么您对它有什么概括性的总结呢？系统的哪些优势对您的质控工作帮助最大？

来源:徕卡显微系统https://mp.weixin.qq.com/s/O4b7hcVhermpLAeux5w-ag