显微课堂｜如何给显微镜消毒

由于目前冠状病毒的流行，人们对安全使用显微镜的去污方法提出了很多疑问。显微镜通常由多个用户共用，因此可能存在微生物污染的风险。此外，微生物本身也可以作为使用显微镜观察的标本。因此，强烈建议经常对显微镜进行消毒。为避免感染，还建议使用一次性手套进行显微镜操作、清洁和去污。如有必要，可使用酒精等对一次性手套进行去污处理，或应经常更换手套，以最大限度地降低污染风险。

注：徕卡显微系统不对与徕卡显微镜有关的次氯酸钠和其他释放氯的化合物的适用性作任何声明，因为它们的使用不在制造商的建议范围内。

传染源

显微镜等实验室仪器的表面可能会受到来自用户或标本本身的微生物的污染。因此，应定期对用户接触点（如目镜、调焦旋钮和显微镜主体）以及计算机键盘和鼠标进行消毒。

传染源可按对消毒剂的耐药性递减分类如下（1表示耐药性最强，6表示耐药性最低）：

1

细菌孢子

2

分枝杆菌

3

无包膜病毒

4

真菌

5

植物细菌

6

有包膜病毒

细菌孢子对消毒剂的抵抗力最强。这些休眠状态的细菌不活动，可以在非常困难和极端的条件下生存。分枝杆菌的细胞壁与其他细菌不同。除了正常的细胞壁外，它们还有一层霉菌酸，因此具有很强的抵抗力。非包膜病毒周围没有脂质双分子层，这与包膜病毒（如冠状病毒）不同。脂质双分子层可以被酒精甚至洗涤剂破坏，因此有包膜病毒更容易对付。无性繁殖细菌没有细菌芽孢的特殊细胞壁，含有水分，因此更容易受到消毒剂的影响。此外，还有被称为朊病毒的传染性蛋白质物质。

消毒方法

针对微生物最有效的消毒方法是利用热量。例如，将材料置于火焰或蒸汽中，或在水中煮沸。在显微镜下这样做可能会对显微镜造成严重损坏，因此最好不要使用显微镜，还有更温和的消毒方法。

实验室仪器和表面通常使用含酒精、醛类、氯化合物、酚类和过氧化物的液体进行清洁。单一成分的消毒效率取决于其在液体中的浓度以及与材料的接触时间。此外，不同的微生物对特定消毒剂有不同的耐受性。罗伯特-科赫研究所将消毒剂细分为四个亚类：

A

杀灭包括分枝杆菌在内的无性细菌以及真菌及其孢子

B

灭活有包膜和无包膜病毒

C

杀死炭疽孢子

D

杀死气肿病菌和破伤风病菌的孢子

请记住，并非显微镜的所有组件和材料都能抵抗化学品。例如，橡胶、胶水、塑料部件或光学部件的表面涂层可能会受到某些消毒剂的不利影响。

酒精（乙醇、异丙醇）属于上述消毒剂的A组。它们对植物细菌有效。众所周知，酒精会对橡胶或某些塑料等材料产生不良影响。

醛类属于A组和B组。不过，甲醛等醛类物质对人体有害。除了呼吸道问题和皮肤过敏，它们还可能致癌。这就是为什么Leica Microsystems严禁使用甲醛、福尔马林或其他醛类物质以及以它们为基础的清洁剂。

如果必须使用甲醛，则应完全覆盖系统。显微镜光学元件非常敏感，需要加以保护，以免受到有害试剂的影响。在对房间进行全面消毒的情况下，强烈建议覆盖或卸下这些部件并进行手动清洁。为避免损坏光学器件，请按照指定手册中的显微镜清洁说明进行清洁。

氯化合物分为A组和B组，可杀死无性细菌和病毒。次氯酸盐是最常用的消毒氯化合物。它也被称为家用漂白剂。要有效消毒，最佳pH值为6-8，次氯酸钠浓度为0.5-1%。

过氧化氢是一种强效消毒剂。过氧化氢化合物属于A组和B组。不过，浓度越高越有害，会影响阳极氧化金属表面。过氧化氢不能很好地用作黄铜部件的消毒剂。此外，它还会损坏物镜的表面和特殊涂层。

建议

任何时候都要将安全放在第一位！

请阅读您计划使用的部件的相关安全数据表！

显微镜（宽视场、共焦或立体）系统的所有表面均已成功通过10%过氧化氢溶液、酒精和软性清洁试剂的测试。对于清洁或去污，我们建议使用下面提到的试剂进行广泛的湿擦拭消毒。

除了消毒剂，您还需要棉签（羊毛棒）、光学布、镜片清洁纸和乳胶手套。这些物品都是一次性的，只能使用一次，然后扔掉。

定期清理

鉴于上述特点，我们建议定期使用酒精消毒湿巾或蘸有酒精消毒剂的软纸巾进行清洁。请遵守相关消毒剂的使用说明和接触时间。

评论： “欧洲疾病预防和控制中心”引用的参考资料显示，与0.06%的次氯酸钠相比，70%的乙醇在与硬表面接触1分钟后对两种不同的冠状病毒（小鼠肝炎病毒和传染性胃肠炎病毒）有更强的杀灭效果。

特殊清洁

A) 次氯酸钠或其他氯释放化合物形式的氯对病毒具有活性，是艾滋病毒和肝炎病毒的首选消毒剂。要有效消毒，最佳pH值为6-8，次氯酸钠浓度为0.5-1%。次氯酸盐溶液应与表面接触至少10分钟。然后用蒸馏水冲洗，晾干仪器。有效净化朊病毒的推荐化学消毒剂是1:5至1:10稀释的次氯酸钠（即5.25%-6.15%的次氯酸钠，提供10,500-12,300 ppm的氯）。稀释后的次氯酸钠溶液应与待消毒表面接触至少15分钟。然后再用蒸馏水冲洗一遍，晾干。

B) 可使用浓度为3%的过氧化氢来杀灭无性细菌、病毒和真菌。与器械表面的接触时间至少应为10分钟。然后，用蒸馏水冲洗并晾干仪器。

有些显微镜系统有用于空气冷却的开口，在任何时候都不应遮盖。如果显微镜系统在使用过程中受到空气污染，那么当冷却风扇工作时，受污染的空气可能会流入设备。如果计划使用过氧化氢蒸发法进行室内净化，则应拔下系统插头并完全切断电源。一旦系统完全关闭且断电，就可以允许气化的气溶胶进入设备内部，因为气溶胶不应该导致冷凝。

其他信息

除了清洁显微镜设备本身，还可以在使用前用塑料薄膜覆盖所有易受污染的接触点。使用后，可以对这些塑料薄膜进行去污处理或更换干净的塑料薄膜。为避免感染，还建议使用手套。必要时，可使用酒精对一次性手套进行消毒，或在使用后更换手套，以最大限度地降低污染风险。

有关可接触到的光学部件（如物镜的前透镜）的清洁，请参阅徕卡网站上或显微镜使用手册中有关清洁光学部件的信息。

显微镜的内部光学元件和滤光片只能由Leica Microsystems CMS GmbH授权的技术服务人员清洁。

对于所有IT设备，也请遵循当地IT部门提供的指导。

切勿使用研磨剂或清洁剂。研磨剂会刮伤表面，从而对显微镜部件的保护涂层产生负面影响。

资料来源

• Liste der vom Robert Koch-Institut geprüften und anerkannten Desinfektionsmittel und -verfahren; Bundesgesundheitsbl 2017 · 60:1274–1297 © Springer-Verlag GmbH Deutschland 2017

• Centers for Disease Control and Prevention (U.S. Department of Health & Human Services)

• Leica Science Lab: How to Clean Microscope Optics

• European Center for Disease Prevention and Control

来源于徕卡显微系统官方公众号

荧光激发和发射的基本原理

荧光染料是光敏化合物，能够吸收特定波长的光能，并转化为波长更长的光。因此，荧光染料是细胞和组织研究中常用的检测试剂。荧光染料特有的电子构型让其具有独特的特征性吸收光谱（常与激发类似）和发射光谱。这些吸收和发射光谱显示了荧光的相对强度，通常纵坐标为相对强度，横坐标为波长。对于已知的荧光染料，制造商会告知光源激发强度峰值的波长，以及荧光发射强度峰值的波长。对于这些荧光染料的激发和发射光谱图与曲线来说，了解其来源很重要。

如何确定荧光染料的发射光谱

确定特定荧光染料的发射光谱时，需要确定最大吸收波长（常等同于最大激发波长）并在该波长下激发该荧光染料。图1(a)中显示了一个典型荧光染料的吸收光谱，纵坐标为吸收的相对强度，横坐标为波长。然后，我们用一个单色器（一种仅允许窄光波段通过的装置）进行扫描，得到全范围发射波长下相对应的荧光发射强度值。图1(b)中显示了基于各波长下荧光相对强度的测量值绘制的发射光谱。确定特定荧光染料的激发光谱时，也采用了类似的方法，即在用一组连续的波长激发荧光基团的同时，监测不同波长下的最大荧光发射强度。确定最大荧光发射强度，并只允许最大荧光发射强度对应波长的发射光通过检测器。在各激发波长下（通常通过单色器）诱导激发，并测量作为波长函数的发射荧光强度。测量结果可绘制为如图1(a)所示的图形或曲线，描绘了全范围激发波长光谱相对应的荧光强度。

激发和发射光谱的观察结果

一组典型的激发和发射曲线或光谱可让我们得到多个观察结果。激发光谱的长波长端和发射光谱的短波长端之间通常会有一个重叠区域。在荧光显微镜中，激发和发射强度与波长的重叠区域（如图1(c)所示）必须通过选择适当的激发滤光片、分光镜（反射光荧光）和发射滤光片来消除。否则，激发光太亮会掩盖较弱的荧光发射光，从而显著降低标本的对比度。

斯托克斯定律

当电子从激发态进入基态时，会有振动能损失（这一现象的解释见“荧光的分子机理”）。因为波长与辐射能成反比()，能量损失使发射光谱较相应的激发光谱更长。这种现象被称为斯托克斯定律(Stokes’ Law)或斯托克斯位移，由George G. Stokes爵士在十九世纪中期发现。斯托克斯位移越大，就越容易分离激发光和发射光。为了获得最高的荧光强度，最好在荧光染料激发波长的峰值处进行激发，在发射波长的峰值处（或由观察者选择的其他波长下）进行检测。激发波长和发射波长的选择由合适的滤光片控制，从而可限制允许通过的波长。在确定整个光学系统的光谱效果时，要求进行额外的技术校正，需要考虑诸如玻璃的透射率和检测器的灵敏度对应不同波长的差异等因素。

图2显示了一个典型荧光染料的吸收-发射光谱图。请注意，这一典型荧光染料的吸收（常与纯化合物的激发曲线相似）和发射荧光强度曲线在形状上有些相似。此外，在激发曲线的长波长端和发射曲线的短波长端有部分重叠。

激发和发射波长的分离

激发和发射波长的分离可通过选择适当的滤光片阻止或放行光谱中的特定波长而实现，如图3所示。荧光照明器的设计是基于对激发光和发射光的控制，即在通向样本的（激发）光路和样本所产生的（发射）光路中插入可随时更换的滤光片。考虑到发射强度低的情况，选择的激发光源必须有足够的亮度，这样才能最大限度地检测到相对较弱的发射光，同时选择的荧光染料需要具备合适的吸收和发射效率。

荧光染料吸收激发光的效率称为分子消光系数。分子消光系数越大，给定波长范围内光吸收的可能性就越大（诱发荧光发射的前提条件之一）。发射光的产率称为量子产率，即发射的量子数（能量“包”）与吸收的量子数之比（许多商用荧光染料的产率在0.1和0.9之间）。量子产率低于1是能量通过非辐射路径（如热或者光化学反应），而不是通过荧光的再辐射路径损失能量的结果。表1中给出了一组特定荧光染料的荧光量子产率。请注意，有些荧光染料的量子产率似乎很低（苯），而其他则很高（荧光素和罗丹明-B）。

荧光染料的荧光量子产率

表1

光源的分子消光系数、量子产率和平均发光强度（固有亮度）以及荧光寿命（激发态的持续时间）都是影响荧光发射强度和可用性的重要因素。此外，荧光染料周围的局部环境是决定荧光发射特性的关键因素。环境中的溶剂粘度、离子浓度、pH值和疏水性等变量，对荧光强度和激发态的寿命都有着重要影响。

荧光的分子机理

另一种描绘荧光活性的方法是雅布隆斯基(Jablonski)图，如图4(a)所示。激发前，分子的电子构型通常处于基态下。吸收了激发光的一个光子后，电子可能在短短的几飞秒（10^-15秒）内获得更高的能量跃迁到振动激发态。

在大约万亿分之一秒（皮秒或10^-12秒）内，激发态电子可能会向周围环境中释放部分振动能，并返回到最低激发单重态。随后，电子可从最低激发单重态“弛豫”回到基态，同时发射荧光，如图4(a)所示。发射光的波长始终比激发光波长长（斯托克斯定律），而且只要激发光一直照射荧光标本，发射光就会持续存在。如果激发光停止，发射荧光也会消失。

有时，激发后的电子不会在振动效应下弛豫到最低的单重态，而是向激发三重态进行跃迁，然后再回到基态，在这个过程中，辐射的发射现象可明显延迟几秒或更多时间。这一现象是磷光的特征，如图4(b)所示。在某些情况下，激发后的电子可能会从三重态回到最低的激发单重态，然后再回到基态，随后发射荧光。这一作用的时间比通常的荧光略长（约一两微秒），称为延迟荧光（图4(c)）。在光漂白或存在重金属盐或其他化学物质等其他情况下，发射光可明显降低甚至完全消失。

褪色或光漂白

有些特定条件可影响受激发的荧光基团的再辐射，从而导致荧光强度下降。这种降低发射光强度的现象通常称为褪色或光漂白。有时会将褪色进一步细分为淬灭和漂白。漂白是荧光分子在分子氧存在下由于光强而发生的不可逆分解。淬灭也会导致荧光强度降低，且常由氧化剂的作用或存在重金属盐或卤素化合物而导致。

通常，淬灭是由于能量从激发态荧光基团转移到物理上接近的其他受体分子而形成的，也称为共振能量转移。这种特殊的现象已经成为一种更新技术的基础，这种技术用于测量远低于光学显微镜横向分辨率的距离。

漂白的发生导致了FRAP技术的形成，即荧光漂白后恢复技术。FRAP技术利用短脉冲激光漂白，从而可观察随后因荧光基团扩散到漂白区域中而引起的荧光恢复现象。

常用抗淬灭试剂的特性

表2

为了降低部分样本的褪色程度，建议在光到达激发滤光片之前的光路中使用一个中性灰度滤光片，可以降低激发光的强度。在其他情况下，可改变封片剂的pH值或使用抗漂白剂（表2中列出了几种较为重要的试剂）可减轻褪色效应。在数字成像、显微成像或简单目视观察时，快速改变观察视野也可避免褪色效应。

什么是数字成像？

数字成像是一个用于描述图像的电子记录的广义术语。您几乎可以用数字方式捕捉任何图像——从日落风景到显微镜标本，再到扫描文档。

什么是数字图像？

数字图像是由一系列像素或图片元素组成。通过计算机读取图像文件并显示像素就可以在显示器上显示图像。

数字成像有何优点？

显微镜数字成像的四个核心优点：

• 永久记录：您可以在不降低图像质量的情况下无限复制同一幅数字图像。所以数字成像可帮助您保存科研载玻片并避免样品降解问题。

• 图像共享：数字图像可以通过电子方式发送给远方的同事，帮助您节约邮寄协作项目载玻片的运输费用。

• 图像调整：使用像cellSens成像软件这类用于显微镜的图像采集处理程序，您只需点击几下即可轻松处理原始数字图像，解决对比度不佳和噪点过多等问题。

• 定量分析：数字成像可以为定量图像分析提供数据，帮助您获得新的信息。比如说，您可以将数据与数据库中以前的成像结果进行比较。

如何提高显微镜的数字成像质量？

为了提高显微镜图像的质量，就要选择匹配您应用的光学器件和相机。

我们提供的在线资源可以帮助您找到供实验使用的显微镜物镜和相机。本博客就是一个很好的起点。更多指导信息，请参考我们的博客文章：如何选择合适的显微镜物镜：10个问题和选择合适显微镜相机的4种工具。

哪个显微数码相机功能参数最为重要？

影响图像质量的因素有很多。通常来说，可以先从相机分辨率和灵敏度开始。灵敏度是指相机传感器检测来自样品光线的能力。分辨率是指相机可捕获的细节程度。但正如我们之前提到的，这些功能必须要与您的光学器件、系统和应用保持一致。

举个例子：高分辨率的相机与低数值孔径的物镜并不搭配，因为其无法恢复经光学元件损失的样品结构信息。原因在于光分布的距离超过了相机的像素间距。在这种情况下，较低分辨率的相机将更适配较低数值孔径的物镜。

再比如，您需要在700~900nm波长范围内观察。那么选择能够感知该波长范围的相机非常重要。

另外还有许多其他因素需要考虑，因此请务必阅读我们的白皮书：选择显微镜相机时应当考虑的因素。

我们应该选择哪种类型的显微镜相机传感器？

几种类型的相机传感器各有优缺点：

• CCD是电荷耦合器件的首字母缩写。简而言之，CCD是具有光敏区域并作为数码相机传感器使用的半导体芯片。CCD传感器捕获光子并将其转换为电荷，而电荷则是用于成像的数字像素数据。传统上看，CCD传感器是科学研究应用的最佳选择。但是随着新传感器技术的出现，这种较为老旧的技术正逐渐风光不再。

• EMCCD代表电子倍增电荷耦合器件。EMCCD是一种可以将高于CCD读取噪声的弱光信号放大的CCD传感器。在传统CCD中，极低的信号水平通常低于传感器的读取噪声，因此其成像能力在以快速帧率捕捉极低光照水平下图像的应用中受到限制。
  EMCCD相机以检测弱光而著称，所以您可能有时候听见有人将其称为弱光相机。由于具有较高灵敏度，它因此成为在极弱光线下捕捉快速生物现象的有效工具。

• CMOS即互补金属氧化物半导体，也是CCD技术的后继产品。CMOS和CCD之间的首要区别是信号电子的读取架构。
  由于为单光敏二极管提供多读出放大器，CMOS的读取速度明显快于CCD。快速读取的弊端在于卷帘快门失真。由于CMOS快速扫描整个图像以收集数据，而非每次捕捉一个像素，因此曝光时间差有时会导致失真。
  相比之下，CCD传感器可以通过在存储电荷同时收集入射光子避免这种失真，从而让其能够同时读出每个像素。
  传统上，CMOS的信噪比低于CCD，但现在已经推出很多高质量的CMOS相机。另外，全局快门CMOS的引入解决了卷帘快门失真问题。

• sCMOS是科研级互补金属氧化物半导体的缩写，通常也缩写为科研级CMOS。 sCMOS是一种具有大尺寸像素和低噪声性能的CMOS传感器。其具备比常规CMOS更高的灵敏度。通常我们会像冷却CCD传感器一样，通过对sCMOS进行冷却来最大限度减少暗电流，以此获得更高的信噪比。
  sCMOS和EMCCD相机之间最重要的区别是sCMOS相机不具备长时间曝光的能力。对于需要长时间曝光或具有弱荧光信号的生物发光成像应用，EMCCD相机是首选，而sCMOS相机由于其能够与多种成像技术配合使用而广受欢迎。

光学显微镜：单目、双目、三目之间的区别

关于徕卡单目显微镜、徕卡双目显微镜、徕卡三目显微镜之间的区别主要是目镜的个数不同。

单目显微镜只有一个目镜，只能用一个眼睛进行观察，是单光路通道。双目显微镜有两个目镜，可以双眼同时观察，是双通道光路。三目显微镜除了可用双眼来观察两目外，还有一目是用来外接电脑和数码相机的。可以通过外接电脑或者数码相机对物体进行观察、记录。

市面上常见的是双目显微镜和三目显微镜。三目显微镜又是双目显微镜的延伸、扩展。三目显微镜在内部设计分光棱镜或者多组棱镜配置的时候，可将显微镜光线通过设计分别输出双目和第三目。三目显微镜在于能达到显微镜链接电脑或者相机进行拍照，图像处理，遥控显微镜操作等功能。

有助呈现生物样本的未染色透明结构

相差是一种光学显微镜技术，用于增加未染色样本的对比度。未染色样本的结构，例如活细胞或其细胞器，在明场照明下观察时可能显得模糊，甚至变得透明。若使用相差显微镜观察相同的样本和结构，就能以更高的对比度和更丰富的细节，清楚呈现这些样本和结构。

利用相移进行成像

由于人眼或光电传感器仅能观察到光波振幅（即强度）或波长（即颜色）的变化，因此对样本进行染色可以诱导振幅变化，导致光线穿过样本后在强度和/或颜色上出现差异^[1]。会引起光波振幅变化的样本或其结构称为振幅物体^[1]。染色剂非常有用，因为它们可以针对样本中的特定结构染色，不过它们可能导致活细胞中毒。

相差显微镜能够利用光路长度差异引起相移，从而视觉呈现原本难以观察到的模糊样本结构^[1]。它借助新形成光波的干涉将相移转化为振幅偏移。在光线穿过时会引起相移的样本或其结构称为相位物体^[1]。

相差显微镜技术诞生于1930年代，由荷兰物理学家弗里茨·泽尼克发明^[1-3]。1942年，这种技术投入实际应用，而泽尼克本人也于1953年获得诺贝尔物理奖^[4]。

图1：利用相差技术和明场照明拍摄到的犬肾细胞（MDCK）图像。

图2：利用相差技术和明场照明拍摄到的单细胞生物变形虫变形杆菌图像

光波干涉

光路长度（OPL）是介质的折射率（n）与光线在介质中两点之间传播距离（d）的乘积。OPL = nd。光路可能需要光线穿过多种介质，例如气体、液体或固体。常见示例包括光线从空气进入水中，或者从空气进入玻璃。光路长度与光线的传输时间和速度有关。光路长度的差异导致光波穿过样本的速度不同，即相移。因此，相位存在差异。与周围介质相比，较高的折射率会导致光波减速并降低相位。

干涉描述了两道光波之间的相互作用，并按照叠加原则形成新的波形。光波干涉的相关参数是它们的振幅。如果两道波相互干涉，生成光波的振幅等于每个干涉光波振幅的矢量和。

如果形成光波的振幅增大，这种干涉可以描述为相长干涉（构造性）。只要两者的波峰和波谷在同一个时间点相遇，就会出现这种情况。也有可能，一道光波的波峰与另一道的波谷在同一个时间点相遇。这种情况会导致形成振幅较低的光波。这两道光波之间的干涉称为相消干涉（破坏性）。

相差显微镜中的光路

相关显微镜的关键元件是环形光圈和相位板。环形光圈位于聚光镜的前焦平面内，限制了光波穿透的角度。相位板位于物镜的后焦平面内，搭配相差环，其材料可以按照λ/4的幅度调暗穿过相位板的光线，其中λ代表光线的波长。

在采用科勒照明的相差显微镜^[5]中，不与样本相互作用的光波在物镜的后焦平面上聚焦为明亮的光环。光环沿光轴方向上与相差环形成空间匹配，引发未偏离光的相移。样本衍射产生的光线并不完全照射在相差环上，因此不受影响。

受影响和未受影响的光波之间，最高可以形成λ/2的总相移。未偏斜光的相位在相差环处会提前λ/4，穿过生物样本时的衍射或散射光波通常会延后λ/4。λ/2的总相移会令光波在图像平面内产生相消干涉。为了增强对比度，未偏斜光在穿过相差环时会变暗并且有一部分光线会被相差环吸收。一定要避免未偏斜光比偏斜光更加明亮的情况，因为那会降低对比度。

相差显微镜中观察到的λ/2相移会产生最大程度的相消干涉效应，因为光波的波峰和波谷在同一时间点重合。因此，生成光波的振幅会减少，相位物体的相移转换为振幅偏移。

图3：相差显微镜中的光路穿过聚光镜环的环形光线通过聚光镜聚焦在样本上。部分环形光线被样本的光学致密结构（例如细胞膜、细胞器等）衍射，出现大约¼λ（通常适用于生物样本）的相移。这种相移和衍射光会绕过相差环，因此几乎不受相差环（通常位于物镜的后焦平面内）的影响。相反，来自聚光镜环的直射环形光线会直接到达相差环，后者会调暗直射光并引起相移（通常提前¼λ或延迟¾λ，以获得正相差）。由于样本折射光线与穿过相差环的光线之间存在高达½λ的总相移，因此会产生相消干涉。所以，光学致密结构会显得更暗（正相差）

图4：相差环是相差显微镜的核心部件。通常它由灰色滤光片和保留板组成。穿过样本且未发生衍射的光线部分穿过相差环（左箭头）灰色滤光片会让光线变暗以避免辐射。保留板会延迟非衍射光的相位，以便与穿过样本时发生衍射并经历相移的光波形成干涉（右箭头）

正相差和负相差——两种形式的相差

相差分为两种形式：正相差和负相差两者的主要区别在于使用的相位板。对于正相差，穿过相差环的光线相比偏斜光会增加，对于负相差，相位会减少。负相差中的相位延迟会产生相位差异，导致光波受到破坏。光波存在相位，并引发相长干涉，而非相消干涉，导致生成的光波振幅增加。

在正相差显微镜中，折射率高于周围介质的对象比折射率较低的对象显得更暗。在负相差显微镜中，情况完全相反。

解读相差图像

相差显微镜可以视觉呈现光线穿过样本时的光路长度差异。光路长度与样本的厚度和折射率有关。细胞膜和细胞器等细胞结构对于光路长度具有深远的影响。由于许多细胞（特别是细胞培养液中）具有扁平且规则的形状，因此使用明场显微镜几乎无法看到它们。

这种细胞相差图像可以放大细胞结构的差异，可以视为光致密图，因为光密度对于样本或样品的折射率有很大影响。不过，多种效应会导致相差图像的正确解释变得复杂，因为它们不直接取决于光路长度的差异。

光晕效应可以描述大型相位物体周边出现的正相差亮边或负相差暗边。光晕会形成是因为来自样本的部分衍射光会穿过相差环。未偏振波形成的光环要比相差环小一点，因此来自样本的低空衍射光波可以穿过相差环。穿过相差环的偏斜光保持着90°的相差，因此不受干涉的影响。这会导致对比度反转，导致大型物体的边缘出现光晕。

遮光效应是指样本的均匀部分和周围介质一样，以相同的光强度来显示所发生的情况虽然穿过这些区域的光线会发生相移，但只有轻微的衍射，且散射角度大幅降低。因此，这些光波进入相差环时，就像未偏斜光一样，不会发生干涉。

相差显微镜的另一个问题就是可能发生对比度反转。如果折射率很高的物体旁边是折射率较低的物体，它们就会显得更加明亮，而不是更暗（正相差的原因）。在这些区域，相移不是生物样本常见的λ/4，因此会出现相长干涉，而不是相消干涉（这与负相差正好相反）。

虽然这些效应会让相差图像在解读时更加困难，但相差显微镜是一种简单且重要的光学对比成像技术，可以对相位物体成像。此外，相差显微镜能够研究活体样本中的细胞功能和结构，因此是生物学研究中最为常用的光学对比法。

图5：曲霉菌的相差图像

图6：大鼠睾丸的相差图像

参考文献：（上下滑动查看更多）

1.E. Hecht, Optics, 5 Ed., Ch. 13 Modern Optics: Lasers and Other Topics, Sec. 13.2.4 Phase Contrast (Pearson, 2017), ISBN13: 9781292096933. www.pearson.ch/HigherEducation/PhysicsAstronomy/AdvancedPhysicsOptics/EAN/9781292096933/Optics-Global-Edition

2.F. Zernike, Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects, Physica (1942) vol. 9, iss. 7, pp. 686-698, DOI: 10.1016/S0031-8914(42)80035-3.X. www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S003189144280035X

F. Zernike, Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects part II, Physica (1942) vol. 9, iss. 7, pp. 686-698, IN1, 981-982, IN3, 983-986, DOI: 10.1016/S0031-8914(42)80079-8. www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0031891442800798

4.F. Zernike, Nobel Lecture, Nobel Prize in Physics 1953, Nobel Prize Organization (2023). www.nobelprize.org/uploads/2018/06/zernike-lecture.pdf

5.M. Wilson, Koehler Illumination: A Brief History and a Practical Set Up in F

来源于徕卡显微系统微信公众号

https://mp.weixin.qq.com/s/SwICZf-aFWcI9TsOdpE3mw