明场显微镜对于许多透明生物标本通常只能提供低对比度图像，无法区分很多细节。 提高明场显微镜对比度的一种方法是使用选择性染色剂，但这种染色剂通常对活细胞有毒。 使用相差光学显微镜，无需染色就可以更大对比度观察各种类型生物标本的结构。 相差方法利用样本结构之间的光密度差异，使光与样本及其结构相互作用后发生相位变化。

徕卡显微镜为各种生命科学和法医学应用中的细胞或组织研究提供相差方法。 相差方法在某些材料科学和地球科学应用中也非常有用。

什么是相差？

相差显微镜有哪些用途？ 这类显微镜可以将哪些类型的样本可视化？

相差显微镜如何工作？

相差显微镜类似于传统的宽场显微镜，不同之处在于它使用环形光圈和四分之一波片（λ/4）相位板。 环形光圈位于光源和聚光镜之间，相位板位于物镜后面的显微镜光学器件中。 环形光穿过光圈，被聚光镜聚焦到待观察的生物标本上。

部分环形光被样本的光密结构衍射，发生约λ/4的负相位差。 发生相位差的衍射光绕过四分之一波片。 与此不同，另一部分环形光直接穿过样本，不发生偏离，到达相位板后发生λ/4正相位差。 被样本结构衍射的光与穿过相位板的光之间的总相位差约为λ/2，因此会发生相消干涉。 因此，光密度高的细胞结构看起来就会比光密度低的结构更暗。

更多信息请参考以下文章：https://www.leica-microsystems.com/science-lab/phase-contrast

显微镜分辨率：概念、因素和计算

艾里斑、阿贝衍射极限和瑞利判据

在显微镜学中，‘分辨率’一词用于阐述显微镜对细节进行区分的能力。换言之，这是样本内两个能被观察人员或者显微镜摄像头区分的实体点之间的最小距离。

显微镜的分辨率本质上与光学元件的数值孔径（NA）以及用于观察样本标本的光波长有关。此外，我们必须考虑Ernst Abbe于1873年首次提出的衍射极限。

本文章包含了这些概念的历史介绍并使用相对简单的术语对其进行了解释。

分辨率与数值孔径

数值孔径（NA）与光通过的介质的折射率（n）以及给定物镜的孔径角（α）有关（NA=n × sin α）。显微镜的分辨率不仅取决于物镜的NA，还取决于整个系统的NA，要把显微镜聚光镜的NA也纳入考虑。在显微镜系统中，所有光学元件都正确对齐、具有相对较高的NA值并且相互协调工作，可以分辨出更多的图像细节。分辨率还与标本成像所用的光波长有关；波长越短，可分辨的细节越多，波长越长则分辨细节越少。

在处理分辨率时需要考虑三个数学概念：‘阿贝衍射极限’、‘艾里斑’和‘瑞利判据’。以下按时间顺序逐一介绍。

George Biddell Airy（1801-1892）是英国数学家和天文学家。1826年，25岁的他被任命为三一学院的数学教授，两年后，被任命为新剑桥天文台的天文学教授。1835年到1881年期间，他是“皇家天文学家”，月球和火星上各有一处以他的名字命名的陨石坑。

1835年，他在剑桥哲学学会学报上发表了一篇题为《有关圆孔径物镜的衍射》的论文。Airy在论文中以一个天文学家的视角描述了通过一个精良的望远镜观察到的恒星周围的光环或者射线的形状及亮度。尽管是从不同的科学领域发表的文章，但这些观察结果与其他光学系统，特别是显微镜存在着关联

艾里斑(Airy Disc)是在衍射限制的系统中由圆形孔径形成的聚焦的光点。如图图1所示，其呈现为中央亮点和周围是明暗相间的同心环（更准确地说，这是艾里图案Airy pattern）。

衍射图案由光的波长和光所通过的孔径大小决定。艾里斑的中心点含有大约84%的光强，其余16%分布于环绕该点的衍射图案中。当然，用显微镜进行观察时标本上会有许多光点，因此基于大量的艾里图案来考虑，而非如“艾里斑”描述的单个光点来考虑是更妥当的方式。

图1右所示的艾里图案三维表示又称为‘点扩散函数’。

Ernst Karl Abbe（1840-1905）是一位德国数学家和物理学家。他与Carl Zeiss共同创立了“蔡司光学工作室”即现在的蔡司公司。除此之外，他还在1884年联合创办了Schott Glassworks。Abbe还是定义数值孔径这一术语的首位学者。1873年，Abbe发表了自己的理论和公式对显微镜的衍射极限进行了解释。Abbe发现，标本图像由许多重叠的、多强度且存在衍射极限的点（或艾里斑）所组成。

要提高分辨率（d=λ/2 NA），标本必须使用波长（λ）更短的光来进行观察，或者通过折射率相对高的成像介质来进行观察，又或者使用NA较高的光学组件来进行观察（或者将全部3种因素组合起来）。

但即便将所有这些因素都考虑在内，显微镜系统的极限依然受到限制，因为系统复杂性，波长低于400 nm的光在玻璃中的传播特征，以及整套显微镜需要达到较高的NA。理想光学显微镜的横向分辨率限制在200 nm左右，而轴向分辨率约为500 nm（有关分辨率极限示例，请参见下文）。

第三代瑞利男爵John William Strutt（1842-1919）是一名英国物理学家，也是一位高产学者。他一生编写了多达466篇论文，包括430 篇科研论文。他的论文涉猎极广，各种主题都有，如鸟类飞行、心理研究、声学等等。1895年，他发现了氩并凭借这一发现于1904年获得诺贝尔奖。

Rayleigh以George Airy的理论为基础上并进一步延伸，于1896年创造了“瑞利判据”理论(Rayleigh Criterion)。瑞利判据（图2）在衍射极限系统当中定义了分辨率极限，换言之，就是何时能够将2个光点相互区分或分辨。

使用艾里斑理论，如果2个单独艾里斑的衍射图案不重叠，则就可以轻松区分、‘分辨’两者并认定满足瑞利判据（图2，左图）。而当艾里斑的中心直接重叠于另一个艾里斑的第一最小衍射图案时，则两者认定为‘刚好分辨’，同时依然可以区分为2个独立的光点（图2，中图）。如果艾里斑再继续相互接近，则两者无法满足瑞利判据，因此“无法被分辨”为2个不同的光点（或者标本图像中的单独细节；图2，右图）。

将以上全部理论都考虑在内就可以明显看出，在计算分辨率的理论极限时需要考虑很多因素。分辨率还取决于样本性质。我们来看一下使用阿贝衍射极限以及使用瑞利判据进行的分辨率计算。

首先应当要牢记：

NA= n x sin α

式中n为成像介质的折射率，α是物镜孔径角的一半。物镜的最大孔径角大约为144º。该角度一半的正弦为0.95。如果使用油浸物镜且折射率为1.52，则物镜的最大NA为1.45。如果使用‘干式’（无浸没）物镜，则物镜最大NA为0.95（因为空气的折射率为1.0）。

横向（即XY）分辨率的阿贝衍射公式为：

d= λ/2 NA

式中λ 是标本成像所用的光波长。如果使用514 nm的绿光及NA为1.45的油浸物镜，则分辨率的（理论）极限将达到177 nm。

轴向（即Z）分辨率的阿贝衍射公式为：

d= 2 λ/NA2

同样的，如果我们假设通过波长514 nm的光来观察标本且物镜NA数值为1.45，则轴向分辨率为488 nm。

在阿贝衍射极限的基础上，瑞利判据稍稍得到了细化：

R= 1.22 λ/NAobj+NAcond

式中λ为标本成像用的光波长。NAobj 为物镜NA。NAcond为聚光镜NA。‘1.22’是一个常系数。该数值根据Rayleigh的贝塞尔函数研究推导得出。这些主要用于对系统当中的问题，例如波的传递，进行计算。

将聚光镜的NA考虑在内，空气（折射率为1.0）通常是聚光镜和玻片之前的成像介质。假设聚光镜的孔径角为144º，则NAcond数值将等于0.95。

如果使用514 nm的绿光，油浸物镜的NA为1.45，聚光镜的NA为0.95，则分辨率的（理论）极限将达到261 nm。

如上所述，用于对标本成像的光波长越短，可以分辨的细节越多。因此如果使用400 nm的最短可见光波长，油浸物镜NA为1.45，聚光镜NA为0.95，则R等于203 nm。

要在显微镜系统当中达到（理论）分辨率的最大值，每个光学组件都应当具备最高可用的NA（把孔径角纳入考虑）。此外，观察标本所用的光波长越短则分辨率越高。最后，整个显微镜系统都应当准直对齐。

但是市面上的盖玻片耗材多种多样，厚薄不一（见表1）。除此之外，在倒置显微镜上，经常会使用诸如培养皿、多孔板等各种不同类型的耗材，有些器皿的底部厚度甚至达到了1-2mm。此时，必须使用带有校正环功能的物镜来进行成像。

表1、MatTek公司不同号码盖玻片及其对应的实际厚度

在倒置显微镜中，经常需要配置长工作距离物镜，因为长工作距离物镜不仅能用于载玻片观察，还能兼容不同底部厚度的器皿，进行活细胞观察。在长工作距离物镜上，我们经常会发现有一圈能左右转动的校正环（图1）。针对不同厚度的耗材，我们需要将校正环调节到不同位置。

图1、带校正环的20倍和63倍物镜。英文简写CORR代表此物镜带有校环，校正环可以左右转动，将环上的小点位置调节至当前使用盖玻片或器皿底部的厚度处。

别小看了这个校正环，它对显微成像会产生很大的影响。我们使用0.17mm盖玻片的样品进行了相应测试。明场成像时，如果校正环调节位置不对，成像清晰度会严重下降，而且是无法通过镜体调焦旋钮来改善的（图2）。在对荧光成像时，校正环设置不准确，除了清晰度下降以外，荧光的亮度也会发生大幅下降（图3）。因此，大家在倒置显微镜上观察时，记得要确认一下物镜是否带有校正环，校正环的位置调节是否正确。

图2、肾脏病理切片的明场成像。成像物镜为带校正环的40倍物镜，校正环位置分别为0（左上），0.17（右上），1.0（左下），2.0mm（右下）。

图3、Mito-TrackerRed标记的线粒体荧光成像。成像物镜为带校正环的63倍物镜，校正环位置分别为0.3（上），0. 7（中），0.17 mm（下）。

但是，倒置显微镜在物镜转盘处的操作空间狭小，对于手指粗壮的男同胞来说，伸手进去调节校正环稍显麻烦。特别是在搭载了双荧光光路和孵育箱的活细胞工作站上（图4），手动调节校正环会变得更加吃力。

图4、搭载双荧光光路的DMi8活细胞工作站（上图配置的为培养小室，下图配置的为大型孵育箱）

一直以来，徕卡将人性化设计贯穿于所有产品之中。针对倒置显微镜物镜转盘处操作空间狭小，手动调节校正环困难的问题，徕卡推出了独家设计的motCORR物镜，可通过外部旋钮和LAS X成像软件，即可对物镜校正环进行全电动调节（图5）。

图5、徕卡motCORR物镜（左），可通过外部旋钮（右下）和LAS X成像软件（右上）进行物镜校正环全电动调节。

尤其是在一些高端成像方式中，经常需要对物镜的校正环进行调节（图6）。motCORR能提供比手动调节更可靠的参数设置，而且更具有可重复性。

图6、徕卡motCORR物镜非常适用的三大应用方向：FCS（左）、多光子（中）和活细胞（右）成像。

如在FCS（Fluorescence Correlation Spectroscopy，荧光相关光谱）成像时，通过motCORR可轻松将共聚焦激发体积调节接近至数学模型，从而得出更加准确的FCS分析结果。其次，在做活体厚组织红外多光子成像时，由于组织内部的折射率不均一，会导致结构扭曲，荧光亮度大幅下降，通过motCORR对样品折射率的校正，以获得亮度和对比度更高的组织深部荧光图像，达到更大的穿透深度。此外，motCORR可与高数值孔径的水镜、水镜自动加水微泵和AFC（adaptivefocus control）自适应稳焦系统全面兼容，轻松实现完美活细胞成像。

来源：徕卡显微系统

DIC显微镜

大多数人在使用显微镜时都采用明场照明。遗憾的是，对很多生物标本来说，明场显微镜通常只提供低对比度图像，在其中几乎无法辨别任何细节。使用染色剂可以增加明场的对比度，但这也有一个风险，即染色剂可能对活细胞有毒。在DIC显微镜中，DIC指的是微分干涉对比法，与明场显微镜相比，其无需染色剂也可以更大的对比度观察多种生物标本的结构。这种光学对比法主要是利用偏振光和样本的厚度或光密度差异，这种差异会导致通过样本的光发生相移。
只有特定的徕卡显微镜具备DIC。其可用于观察各种生命科学或法医学应用中的细胞或组织。DIC显微镜也可用于某些材料和地球科学应用。

什么是DIC显微镜，它的作用是什么?

DIC是微分干涉对比法，这是一种显微镜光学对比技术，通过其可以获得充足的对比度和分辨率，从而观察到未染色的生物标本的细胞结构。它也能帮助观察材料表面上小的高度差异。只用偏振光照亮样本时，偏振光被分散成两束具有正交偏振平面的不同光线。当光线在样本中经过不同的折射或散射后，会出现不同的相移。这些光线再次汇聚时，它们会相互干扰并变成椭圆偏振光。这种偏振光通过分析仪时会变为振幅偏移。在DIC图像中，可以观察到差异小于1/1000个波长的相移（当用相机传感器检测时）。DIC显微图像呈浮雕状，看上去有阴影。

如何设置DIC显微镜？

DIC显微镜是一种宽视场显微镜，在光源镜与聚光镜之间，以及在物镜和相机传感器或目镜之间，都设有偏振滤光器和沃拉斯顿棱镜。如需更多DIC显微镜设置信息，请参阅文章： 微分干涉对比（DIC）与金相学

微分干涉对比（DIC）显微镜是如何工作的？

DIC显微镜是一种使用偏振滤光器和沃拉斯顿棱镜的传统宽视场显微镜。

光源散发出的光会穿过滤光器，变成45°的偏振光。在穿过沃拉斯顿棱镜后，光会被分成垂直偏振分量，其中一个为0°偏振，另一个为90°偏振。聚光镜将光聚集在标本上，再由2束偏振角度不同的连贯平行光线照射到标本上。光线穿过不同的光路长度，因为其穿过样本的路径上可能存在厚度或折射率差异。
最后的结果是，一条光线相对于另一条光线出现相移。垂直偏振光通过物镜和另一个沃拉斯顿棱镜后，重新组合成135°偏振光。根据光路长度的不同，这两束光线的干扰会产生建设性（增亮）或破坏性（变暗）干扰，使得原本用明场显微镜几乎观察不到的结构现在可通过DIC显微镜观察到。
最后，偏振滤光器（也称为分析仪）会将未发生任何相移的直接透射光滤除，其只允许135°的偏振光通过。如需了解详细信息，请参阅文章： 微分干涉对比（DIC）

来源：DIC显微镜 | 产品 | 徕卡显微系统 (leica-microsystems.com.cn)

本报告简要讨论了几种常用于评估表面形貌（也称表面结构或表面光洁度）的重要计量方法和标准定义。随着纳米技术、薄涂层以及电路和装置小型化的出现，表面计量学已经成为一个极其重要的科学和工程领域。其从微米级和亚微米级特征的角度研究表面形貌的精确、代表性表征。这些特征构成了表面的波纹度、粗糙度和层次。形貌在确定许多现代技术、组件、部件和产品（例如电机、涂层、电子设备等）所用材料的机械、热、光学和电气性能方面起着至关重要的作用。

表面表征的光学方法可以具有高垂直（z）分辨率，但不如探针方法或电子显微镜的横向（xy）分辨率。但是形貌采集要快得多。这意味着光学方法可提供大面积的表面形貌数据，使其更适用于可靠、准确的统计分析。

SEM也可获得非常高的分辨率，但需要在真空室中进行成像。如果材料的导电性不够，则在电子束中会发生充电，因此样品必须涂一层导电膜。采集图像通常会很耗时。

来源:徕卡显微系统

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正置显微镜和倒置显微镜的区别

光学显微镜是由两组透镜组成的光学折射系统，其中焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜，焦距较长、靠近眼瞳、成虚像的透镜组则称为目镜。位于物镜前方的观察物体由物镜作放大后成倒立的实像。光学显微镜分为正置显微镜和倒置显微镜

然后，该实像再被目镜作二级放大，在位于人眼的明视距离处，得到放大效果的倒立虚像。通过显微镜机械调焦系统，可以调整并满足相对于物镜的成像条件以及观察者明视距离的二次成像条件。

光学显微镜分为正置显微镜和倒置显微镜。两者区别为：

1、物镜与载物台的相对位置不同：正置显微镜物镜转换盘朝向是向下的，载物台在物镜下方；倒置显微镜的物镜是向上的，载物台在物镜上方。

2.适用条件不同：正置显微镜物镜适合观察切片等；倒置显微镜适合观察到培养皿里面的活体细胞。

3.工作距离不同：正置显微镜物镜工作距离比较短；倒置显微镜工作距离长。

光学显微镜的日常维护保养

光学显微镜是由许多光学元件和金属零件组成，因此保证各光学元件的清洁及系统的稳定，对保持显微镜高效运作，延长其使用寿命大有裨益。接下来就请大家跟随蔡司君一起学习一下光学显微镜日常维护保养的一些相关知识吧。

• 设备放置和使用环境的维护

• 机械系统维护保养

• 光学系统维护保养
  ▪不要用手接触光学零件
  ▪擦镜纸是给油镜清洁使用的，干镜清洁请务必使用脱脂棉签

  ▪油镜使用后用干净柔软的专业擦镜纸蘸无水乙醇采用螺旋渐进的方式轻轻擦干净油的物镜；

  √ 留意擦镜纸的两个面，纹路是不同的：其中一面是粗糙的，另一面更光滑些，要使用更光滑的那一面来清洁。一般不建议用干的擦镜纸直接擦拭，同样可能划伤镜头。

  ▪如果有较顽固污迹或灰尘，先用洗耳球吹走较大较硬灰尘，然后用长纤维脱脂棉签或干净细棉布蘸无水乙醇擦拭，这样可以避免较大较硬灰尘颗粒划伤镜头，影响观察效果。

  ▪目镜和物镜的擦试方法

  √ 准备工作：在长纤维脱脂棉签顶端蘸上无水乙醇

  √ 目镜：从中央部分开始，采用螺旋渐进的方式轻轻逐步擦到边缘

• 使用注意事项
  ▪显微镜样本一定要保持干净，如有盖片样本，一定要干净干燥，以免样本上的试剂污染物镜。
  ▪不要用手直接触摸光学部件的表面（如物镜，荧光滤块，目镜等）。
  ▪手动显微镜换物镜时，不要抓着物镜转，要转动物镜转盘。
  ▪荧光光源金属卤化物灯使用时注意开关间隔最少30分钟。
  ▪样本用油镜观察后，如还需用空气镜观察，要把样本上的油擦干净再观察，以免样本上的油污染空气镜。
  ▪油镜观察时，请使用与显微镜配套的专业镜油，不要使用其他介质（香柏油等），使用完显微镜后，及时擦掉物镜上的镜油，最好将其他物镜也清洁一遍。清洁液以无水乙醇为主。
  ▪调焦时，为避免镜头撞到样本，先将物镜调到离样本最近端，然后在镜下向离物镜远端调焦到样本清晰。
  ▪显微镜使用过程中，镜体、灯箱及电源等位置应无遮挡或覆盖，以免影响散热从而损耗显微镜寿命。
  ▪显微镜使用完后，等灯箱部分冷却后，再盖上防尘罩。
  ▪显微镜包含很多光学部件，避免显微镜碰撞，以保护光学系统。
  
  

关于进口光学显微镜保养事宜

保持光学元件的清洁对于保证有好的光学性能非常有必要，当显微镜不用时，显微镜应当用专门的防尘罩盖住。如果光学仪器上面有灰尘，在擦拭表面前用软毛刷去污物。光学表面可以使用无绒棉布，镜头纸或有专用的镜头清洁液进行清洁。清洁过程中尽量避免过多使用清洁剂，避免溶剂进入目镜背部，造成观察的清晰度下降甚至仪器的损坏。显示镜中目镜和物镜的表面镜头最容易受到灰尘和油黏上。如果发现清晰度下降，甚至出现雾状现象，可以使用放大镜进行检查目镜。

如果发现光学元件上面出现雾状或者霉斑现象，请尽快联系徕卡显微镜维修专业人士，对显微镜进行相关的维护保养工作，让显微镜的工作能够顺顺利利进行。