有助呈现生物样本的未染色透明结构

相差是一种光学显微镜技术，用于增加未染色样本的对比度。未染色样本的结构，例如活细胞或其细胞器，在明场照明下观察时可能显得模糊，甚至变得透明。若使用相差显微镜观察相同的样本和结构，就能以更高的对比度和更丰富的细节，清楚呈现这些样本和结构。

利用相移进行成像

由于人眼或光电传感器仅能观察到光波振幅（即强度）或波长（即颜色）的变化，因此对样本进行染色可以诱导振幅变化，导致光线穿过样本后在强度和/或颜色上出现差异^[1]。会引起光波振幅变化的样本或其结构称为振幅物体^[1]。染色剂非常有用，因为它们可以针对样本中的特定结构染色，不过它们可能导致活细胞中毒。

相差显微镜能够利用光路长度差异引起相移，从而视觉呈现原本难以观察到的模糊样本结构^[1]。它借助新形成光波的干涉将相移转化为振幅偏移。在光线穿过时会引起相移的样本或其结构称为相位物体^[1]。

相差显微镜技术诞生于1930年代，由荷兰物理学家弗里茨·泽尼克发明^[1-3]。1942年，这种技术投入实际应用，而泽尼克本人也于1953年获得诺贝尔物理奖^[4]。

图1：利用相差技术和明场照明拍摄到的犬肾细胞（MDCK）图像。

图2：利用相差技术和明场照明拍摄到的单细胞生物变形虫变形杆菌图像

光波干涉

光路长度（OPL）是介质的折射率（n）与光线在介质中两点之间传播距离（d）的乘积。OPL = nd。光路可能需要光线穿过多种介质，例如气体、液体或固体。常见示例包括光线从空气进入水中，或者从空气进入玻璃。光路长度与光线的传输时间和速度有关。光路长度的差异导致光波穿过样本的速度不同，即相移。因此，相位存在差异。与周围介质相比，较高的折射率会导致光波减速并降低相位。

干涉描述了两道光波之间的相互作用，并按照叠加原则形成新的波形。光波干涉的相关参数是它们的振幅。如果两道波相互干涉，生成光波的振幅等于每个干涉光波振幅的矢量和。

如果形成光波的振幅增大，这种干涉可以描述为相长干涉（构造性）。只要两者的波峰和波谷在同一个时间点相遇，就会出现这种情况。也有可能，一道光波的波峰与另一道的波谷在同一个时间点相遇。这种情况会导致形成振幅较低的光波。这两道光波之间的干涉称为相消干涉（破坏性）。

相差显微镜中的光路

相关显微镜的关键元件是环形光圈和相位板。环形光圈位于聚光镜的前焦平面内，限制了光波穿透的角度。相位板位于物镜的后焦平面内，搭配相差环，其材料可以按照λ/4的幅度调暗穿过相位板的光线，其中λ代表光线的波长。

在采用科勒照明的相差显微镜^[5]中，不与样本相互作用的光波在物镜的后焦平面上聚焦为明亮的光环。光环沿光轴方向上与相差环形成空间匹配，引发未偏离光的相移。样本衍射产生的光线并不完全照射在相差环上，因此不受影响。

受影响和未受影响的光波之间，最高可以形成λ/2的总相移。未偏斜光的相位在相差环处会提前λ/4，穿过生物样本时的衍射或散射光波通常会延后λ/4。λ/2的总相移会令光波在图像平面内产生相消干涉。为了增强对比度，未偏斜光在穿过相差环时会变暗并且有一部分光线会被相差环吸收。一定要避免未偏斜光比偏斜光更加明亮的情况，因为那会降低对比度。

相差显微镜中观察到的λ/2相移会产生最大程度的相消干涉效应，因为光波的波峰和波谷在同一时间点重合。因此，生成光波的振幅会减少，相位物体的相移转换为振幅偏移。

图3：相差显微镜中的光路穿过聚光镜环的环形光线通过聚光镜聚焦在样本上。部分环形光线被样本的光学致密结构（例如细胞膜、细胞器等）衍射，出现大约¼λ（通常适用于生物样本）的相移。这种相移和衍射光会绕过相差环，因此几乎不受相差环（通常位于物镜的后焦平面内）的影响。相反，来自聚光镜环的直射环形光线会直接到达相差环，后者会调暗直射光并引起相移（通常提前¼λ或延迟¾λ，以获得正相差）。由于样本折射光线与穿过相差环的光线之间存在高达½λ的总相移，因此会产生相消干涉。所以，光学致密结构会显得更暗（正相差）

图4：相差环是相差显微镜的核心部件。通常它由灰色滤光片和保留板组成。穿过样本且未发生衍射的光线部分穿过相差环（左箭头）灰色滤光片会让光线变暗以避免辐射。保留板会延迟非衍射光的相位，以便与穿过样本时发生衍射并经历相移的光波形成干涉（右箭头）

正相差和负相差——两种形式的相差

相差分为两种形式：正相差和负相差两者的主要区别在于使用的相位板。对于正相差，穿过相差环的光线相比偏斜光会增加，对于负相差，相位会减少。负相差中的相位延迟会产生相位差异，导致光波受到破坏。光波存在相位，并引发相长干涉，而非相消干涉，导致生成的光波振幅增加。

在正相差显微镜中，折射率高于周围介质的对象比折射率较低的对象显得更暗。在负相差显微镜中，情况完全相反。

解读相差图像

相差显微镜可以视觉呈现光线穿过样本时的光路长度差异。光路长度与样本的厚度和折射率有关。细胞膜和细胞器等细胞结构对于光路长度具有深远的影响。由于许多细胞（特别是细胞培养液中）具有扁平且规则的形状，因此使用明场显微镜几乎无法看到它们。

这种细胞相差图像可以放大细胞结构的差异，可以视为光致密图，因为光密度对于样本或样品的折射率有很大影响。不过，多种效应会导致相差图像的正确解释变得复杂，因为它们不直接取决于光路长度的差异。

光晕效应可以描述大型相位物体周边出现的正相差亮边或负相差暗边。光晕会形成是因为来自样本的部分衍射光会穿过相差环。未偏振波形成的光环要比相差环小一点，因此来自样本的低空衍射光波可以穿过相差环。穿过相差环的偏斜光保持着90°的相差，因此不受干涉的影响。这会导致对比度反转，导致大型物体的边缘出现光晕。

遮光效应是指样本的均匀部分和周围介质一样，以相同的光强度来显示所发生的情况虽然穿过这些区域的光线会发生相移，但只有轻微的衍射，且散射角度大幅降低。因此，这些光波进入相差环时，就像未偏斜光一样，不会发生干涉。

相差显微镜的另一个问题就是可能发生对比度反转。如果折射率很高的物体旁边是折射率较低的物体，它们就会显得更加明亮，而不是更暗（正相差的原因）。在这些区域，相移不是生物样本常见的λ/4，因此会出现相长干涉，而不是相消干涉（这与负相差正好相反）。

虽然这些效应会让相差图像在解读时更加困难，但相差显微镜是一种简单且重要的光学对比成像技术，可以对相位物体成像。此外，相差显微镜能够研究活体样本中的细胞功能和结构，因此是生物学研究中最为常用的光学对比法。

图5：曲霉菌的相差图像

图6：大鼠睾丸的相差图像

参考文献：（上下滑动查看更多）

1.E. Hecht, Optics, 5 Ed., Ch. 13 Modern Optics: Lasers and Other Topics, Sec. 13.2.4 Phase Contrast (Pearson, 2017), ISBN13: 9781292096933. www.pearson.ch/HigherEducation/PhysicsAstronomy/AdvancedPhysicsOptics/EAN/9781292096933/Optics-Global-Edition

2.F. Zernike, Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects, Physica (1942) vol. 9, iss. 7, pp. 686-698, DOI: 10.1016/S0031-8914(42)80035-3.X. www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S003189144280035X

F. Zernike, Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects part II, Physica (1942) vol. 9, iss. 7, pp. 686-698, IN1, 981-982, IN3, 983-986, DOI: 10.1016/S0031-8914(42)80079-8. www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0031891442800798

4.F. Zernike, Nobel Lecture, Nobel Prize in Physics 1953, Nobel Prize Organization (2023). www.nobelprize.org/uploads/2018/06/zernike-lecture.pdf

5.M. Wilson, Koehler Illumination: A Brief History and a Practical Set Up in F

来源于徕卡显微系统微信公众号

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SO 16232标准和VDA 19指南对汽车行业制造过程的重要性

本文讨论了ISO 16232标准和VDA 19指南，并简要总结了颗粒物分析方法。它们为汽车零部件在微粒污染方面的清洁度提供了重要标准。此类颗粒物会对产品性能和寿命产生影响。在清洁度分析中，可以使用自动光学显微镜方法来确定颗粒物类型、大小和造成损坏的可能性。有时，需要更多成分信息，才能准确找到潜在的损害和污染源。这时候就需要借助激光光谱（LIBS）或电子显微镜。

标准化方法可以帮助零部件供应商和产品制造商获得可再现、可靠和可比较的清洁度。汽车和运输行业的主要标准是ISO 16232[1]和VDA 19[2,3]。供应商和制造商在清洁度分析中需要参考标准中常见参数的定义和值范围，例如颗粒物尺寸和成分、颗粒物识别的阈值、图像设置等。汽车行业中用于清洁度分析的颗粒物检测和计数通常符合ISO标准和VDA指南。本文简要概述了ISO 16232和VDA 19中提到的颗粒物分析方法。

对于汽车行业，ISO 16232标准定义了用于确定污染物颗粒大小和数量的方法[1]。从汽车零部件中提取这些颗粒物时，使用液体清洗，并用膜过滤器过滤液体，随后收集表面上的颗粒物。然后使用光学显微镜（手动或使用自动系统）和图像分析技术分析颗粒物[4-6]。最后便可获得粒径分布。
VDA 19指南补充了ISO 16232标准[2,3]。VDA 19更详细地说明：适用范围和有效性、清洁度检查、监测变化、检查方法的选择、测试组件的适当清洁处理、提取程序设置、验证、以及空白测试以及案例研究[2]。此处仅提及VDA 19.1和技术清洁度检查。

通常使用光学系统对滤膜进行全自动分析来验证清洁度。颗粒物检测、测量和分类很大程度上取决于镜头（即放大率和分辨率）、照明类型（例如偏振、明场或暗场）、图像处理软件中使用的阈值以及颗粒物特性（尺寸、成分、反射率等）。因此，在比较相同类型颗粒的结果时，光学系统和分析参数必须相同。
标准光学分析
为了提供有意义的比较，建议进行标准光学分析。标准光学分析中，在确定规范之前定义图像设置和分析过程，因此与使用的系统无关。
颗粒物的检测和测量
测量的精度主要由显微镜镜头的放大倍率和分辨率决定。更高的放大倍率可以提高精度，但也会降低景深。因此，当在高放大倍率下测量小颗粒时，垂直方向的电动平台系统可以补偿低景深和过滤器表面的不规则性。使用高放大倍率还需要分析大量图像，以便全面检查滤光片。因此，必须在测量精度和处理/分析时间之间找到平衡点。
此外，为了准确地确定尺寸和范围，颗粒应均匀分布在过滤器表面上而没有重叠，并以颗粒物所占的表面百分比来报告。
偏光片
交叉偏振器可用于消除金属颗粒的反射，在这种情况下，金属颗粒在明亮的背景上会显得很暗。如果不使用偏光片，当亮区的亮度与背景滤光片的亮度相似时，就有可能将亮区和暗区的颗粒分成几个颗粒。不使用偏光片时，非常接近的颗粒也可能会出现大小和形状的变形，因为当它们靠近在一起时，相邻的颗粒可能看起来很相似，类似于一个更大的颗粒。
颗粒长度和宽度
颗粒的大小和特征可以通过标准分析来确定。颗粒长度，即2条平行线之间的最大距离，Feretmax，其可以应对于2个敏感元件[5]之间的距离，例如电引线，这意味着颗粒能够“连接”它们。宽度或Feretmin是2条平行线[5,6]之间的最小距离，当它对应的通道宽度足以使颗粒通过时，则表示存在潜在的危险。
纤维
纤维在制造过程中也是一个常见问题，但纺织纤维（例如来自服装的纤维）的潜在破坏性弱于纤维状颗粒物，因此应将这些类型相互区分开来。通常，细长长度与最大内径之比大于20且内径小于50 µm的颗粒会被认为是纤维。
金属颗粒
金属颗粒是组件上最常见的污染物之一，由于其机械和电气特性，它们对许多应用具有高危害性。由于光学外观的变化，基本标准光学方法无法可靠地识别金属颗粒，需要使用扩展分析方法。
然而，可以使用非偏振光学系统进行第一次表征，通过其闪亮外观（直方图强度值接近白色的强度值的反射）识别金属颗粒。可以执行自动分析以确定闪亮颗粒是否为金属，但只有在系统参数（镜头类型、放大倍率、其他参数设置等）和颗粒特征（颜色、粗糙度、均匀性等）相同时才能比较结果。如果满足以下两个要求，则可以使用此方法：
通过已使用的参数设置确定颗粒具有金属光泽，但可能需要事先进行扩展分析加以证明
由专业的操作员目视确认自动表征结果
材料和设备
颗粒分析需要以下材料和设备：

• 显微镜
  无伪影均匀光源发出的入射（反射）光
  滤光片必须紧紧固定在样品架上，最好用玻璃盖压平，以确保整个滤光片可以在特定放大倍率下成像
  过滤器的定位使用电动装置完成，精确性应可以观察到最小颗粒
  镜头分辨率和相机传感器的像素数应匹配，以便可以应用10 像素标准，即最小颗粒尺寸应对应于至少10个像素（参见图1）

当需要有关形状、成分、来源、物理特性（硬度、磨损性等）或颗粒造成损坏的可能性等额外或更详细信息时，可以使用扩展分析方法。使用扩展分析可以更确定地识别金属颗粒。
颗粒高度
显微镜镜头的景深(T)可用于估计颗粒的高度(H)。T值随着镜头数值孔径(NA)而减小，因此，在更高的放大倍率和分辨率下会减小。使用以下等式计算：T = 550/(NA)2.H值可以根据颗粒顶部和底部的焦平面之间的垂直差或透镜沿Z轴的运动来确定[5,6]。应记录所有测量的颗粒高度，因为这些数据以及宽度和长度可用于确定潜在的损坏。
成分分析
单个颗粒的成分可以通过使用激光诱导击穿光谱（LIBS）或能量色散X射线光谱（EDS/EDX）进行直接元素分析来获得。LIBS中使用激光脉冲撞击颗粒，形成局部等离子体并发射特定波长的光[7]。然后使用光谱数据库来识别颗粒元素成分。使用扫描电子显微镜（SEM）执行EDS。

市场需要这样一种解决方案：它不仅能使用户满足ISO 16232标准和VDA 19.1指南的颗粒分析要求，同时还可以减少耗费的时间和精力。利用清洁度分析解决方案，用户可以根据ISO 16232和VDA 19的当前要求以及未来可能的更新来分析颗粒。
了解颗粒成分有助于可靠地确定颗粒造成损害的可能性并确定污染源[1,2]。使用二合一材料分析解决方案，结合光学显微镜和LIBS[6,7]，可以有效地执行颗粒的成分分析。目视检查过滤器上的颗粒，然后立即使用LIBS[6]进行化学分析，无需将过滤器转移到另一台仪器或开展额外的样品制备

1. ISO/DIS 16232:2018, Road Vehicles - Cleanliness of components and systems, International Organization for Standardization.

2. VDA (German Association of the Automotive Industry), QMC (Quality Management Center), Volume 19, Part 1, Inspection of Technical Cleanliness, Particulate Contamination of Functionally Relevant Automotive Components, 2nd Revised Edition, March 2015.

3. VDA (German Association of the Automotive Industry), QMC (Quality Management Center), Volume 19, Part 2, Technical cleanliness in assembly, Environment, Logistics, Personnel and Assembly Equipment, 1st edition 2010.

4. Y. Holzapfel, J. DeRose, G. Kreck, M. Rochowicz, Cleanliness Analysis in Relation to Particulate Contamination: Microscopy based measurement systems for automated particle analysis, Science Lab (2014) Leica Microsystems.

5. N. Ecke, Basics in Component Cleanliness Analysis, Science Lab (2017) Leica Microsystems.

6. J. DeRose, K. Scheffler, D.R. Barbero, Key Factors for Efficient Cleanliness Analysis, Science Lab (2020) Leica Microsystems.

7. K. Scheffler, See the Structure with Microscopy - Know the Composition with Laser Spectroscopy: Rapid, Complete Materials Analysis with a 2-Methods-In-1 Solution, Science Lab (2018) Leica Microsystems.

正确的清洁度分析解决方案对质量控制至关重要。本文介绍了选择适合自身需求的解决方案时应考虑的一些重要因素。这些因素取决于不同的方面，例如行业（微电子或汽车）、污染物类型、尺寸、成分、材料属性和可能造成的损害等。

从基本的清洁度验证到更复杂的分析，有多种基于显微镜和激光光谱的清洁度解决方案可供选择。

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介 绍

汽车零部件和电子元件中的微粒子污染会对产品性能和使用寿命产生严重的影响^[1-3]。如果关键部件受到重度污染，车辆或设备系统就会出现重大故障。因此，对于现代制造和生产中的质量保证，清洁度分析在确定颗粒物尺寸和材料属性方面具有重要的作用。为帮助用户选择适合自己需求的正确清洁度分析解决方案，下文列出了一些需要考虑的主要因素。

“

需要考虑的因素

为找到最适合用户需求的清洁度分析解决方案，可以先思考下面的几个问题。

主要应用是什么？

清洁度分析是否会影响组件和零部件的生产与组装，例如汽车和电子行业？如果是，那么这两个行业对颗粒物污染有着严格的要求，包括类型、大小、成分和可能造成的损害等，通常要按照ISO 16232、VDA 19或ZVEI（电子工程技术清洁度）等标准和指南执行分析^[2,4]。或者清洁度分析是针对液压流体、润滑剂、燃油和医药产品？对大多数机械系统而言，需按照ISO 4406和DIN 51455标准来对液压流体、润滑剂和燃油执行清洁度分析^[5]。医药产品清洁度分析通常遵循USP 788标准。由于不同应用的清洁度分析存在重大的差异，选择的解决方案需要能够准确可靠地确定颗粒物分析所要求的各项参数。

图1：示例A)汽车零部件和组件，和B)印刷电路板(PCB)，清洁度分析在质量控制和生产中可以发挥重要的作用。

要分析的颗粒物的尺寸是多大？

在汽车行业中，大颗粒物(>25 µm)和坚硬的颗粒物（陶瓷和金属）由于其磨损性质可能会造成严重的损害。但对于亚微米级的电子元件，即使是较小的颗粒物（5到10µm或更小）也会造成问题。对于流体清洁度，需要分析5µm或更大的颗粒物。选择清洁度分析解决方案时，了解要分析的颗粒物的尺寸非常重要。

图2：清洁度分析中的滤膜里污染物的图片，显示了不同尺寸的颗粒物。

应用需要区分反光颗粒物和非反光颗粒物吗？

反光颗粒物，即导电性颗粒物，通常为金属，相比非导电性颗粒物，通常为非金属，可对汽车零部件和电子元件造成更大的损害。因此，在确定颗粒物可能造成的潜在损害时，如果能够区分反光和非反光颗粒物，会大有帮助。如果清洁度分析解决方案能够帮助用户有效区分反光颗粒物和非反光颗粒物，用户便可以更好地确定颗粒物可能造成的损害。

确定颗粒物材料重要吗？

如果清洁度分析的最终目标是找到并清除污染物来源，则了解颗粒物的成分便十分有用。在这种情况下，理想的解决方案应能够帮助用户高效可靠地识别颗粒物材料。

图3：使用光学显微镜和激光光谱确定的铝合金颗粒物的成分。

来源：徕卡显微系统 https://mp.weixin.qq.com/s/iJ3mZ8KS3LLKLQ1Y315olg

“ 对于病理学家而言，由于需要进行很多显微镜操作、观察……每天工作四到六小时司空见惯，因此拥有完全符合人机工程学的显微镜非常重要。” 英国北米德尔塞克斯大学医院细胞病理学家Delaram Kermani对此深有感触，很遗憾的是，她曾经亲身体验过这类与工作相关的痛苦和伤害。

该显微镜的另一个重要人机工程学特征是载物台及其控制旋钮的高度较低。正如Delaram所述：“我以前所用显微镜的载物台非常高，这就是我经常手腕疼痛的原因。之前曾经在手臂下方用鼠标垫将手垫高。现在我可以将手腕放在桌子上，而不用向上伸。”

奥林巴斯在显微镜和人机工程学方面的专业知识可以帮助预防和减轻与显微镜相关的伤害。

如果用户大部分工作时间都要使用显微镜，那么不良姿势会迅速导致背部、颈部或手腕疼痛。而且，一旦开始感觉到疼痛，可能需要非常缓慢的过程才能康复，并且可能需要彻底改变工作模式，甚至根本无法继续使用显微镜工作。

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来源于：

OLYMPUS生命科学

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