什么是电生理学？

电生理学是针对生物系统，特别是神经元和肌肉细胞等可兴奋细胞内部电气性质和活动的研究。其包括测量、记录和分析这些细胞产生的电信号，最终深入了解其功能和通信。

在此，我们将深入探讨电生理学，包括其历史、未来以及如何在各个领域的实验技术中使用。

电生理学的历史

电生理学领域的悠久历史可追溯到18和19世纪，最早的标志是在了解生物体电气性质方面的重大发现。

可以说，最具突破性的实验之一是由意大利医生Luigi Galvani在18世纪末完成的。在这个实验中，Galvani观察到青蛙的肌肉在与另一个金属物体接触时会收缩。²

他将这一证据解释为“动物电”，从而促进了对生物电现象的全面认识。Galvani实验等早期电生理学实例为该领域的现代研究奠定了基础，使人们对生物体的电气性质以及如何研究生物体的电气性质有了更深入的了解。

进入21世纪后，科学家在很大程度上依赖于实地记录，因为单个细胞的定位极其困难。有了显微镜后，科学家就可以确定细胞的位置，而随着光学设计的进步，例如红外微分干涉对比（IR-DIC），研究人员可以更深入地观察活体组织。

这种显微镜装置与高速相机相结合，可通过钙成像等方法实时观察细胞内部动态。现在，从固定台式电生理学正置显微镜到更先进的成像解决方案，例如激光扫描共焦显微镜和多光子显微镜，这些解决方案正在彻底改变电生理学领域的研究进展。

H line小鼠大脑的冠状切片，青色；DAPI（细胞核），绿色；YFP（神经元），黄色；Cy3星形胶质细胞，洋红色；AlexaFluor 750（微管）。使用1K共振扫描在16分钟内共采集了77个四通道XYZ位置（11 × 7），以创建拼接图像，而过去使用普通检流计振镜扫描需花费两小时。样品承蒙理化学研究所（RIKEN）CBS细胞功能动力学部实验室的Takako Kogure和Atsushi Miyawaki提供。

电生理学有什么用途？

在当今的研究领域，电生理学可用于心脏病学、神经科学等常见领域。在心脏病学中，电生理学最常见的用途是心电图（ECG）。

心电图是一种测量和记录心脏电活动的电生理诊断设备。放置在皮肤上的电极可检测心脏细胞产生的电信号。心电图可提供有关心律、心率和整体电功能的宝贵信息，是诊断和治疗心血管疾病的重要工具。

在神经科学中，电生理学通常用于研究神经元的电气性质，包括神经元如何产生和传输电信号。

膜片钳电生理学有两种主要方法：细胞内和细胞外。细胞内电生理学涉及测量单个细胞膜上的电位。这可提供有关细胞膜电位以及细胞活动（如动作电位）过程中发生的任何变化的详细信息。

膜电位是所有细胞的固有特性，由细胞膜两侧过多的负电荷或正电荷产生。¹动作电位是由带正电荷的离子交换引起的神经元质膜短暂而巨大的去极化和复极化。¹

膜片钳记录广泛用于研究单个细胞（尤其是神经元）的电活动。 它是将玻璃微量移液管电极置于细胞膜上，形成紧密的密封，从而实现对膜电位变化的准确测量。膜片钳技术可通过全细胞、贴附细胞、内面向外和外面向外等几种不同的配置方式进行，每种配置都适用于不同的实验目的。

膜片钳记录配置。（A）贴附细胞：可测量单通道电流。（B）全细胞：可测量整个细胞的电流。（C）内面向外：可测量细胞溶质一侧朝外的小膜片上的电流。（D）外面向外：可测量细胞外侧朝外的小膜片上的电流。图片来源：Ahmadi, Shirin et al.2023 (Frontiers).³

电压钳记录是一种用于测量和控制细胞膜电位，同时测量流过细胞膜的离子电流的方法。²通过这种技术，研究人员可以研究离子通道和受体的特性，最终进一步了解导致动作电位的机制。

电流钳记录是指在测量细胞膜电位变化的同时向细胞注入电流。这种技术用于研究神经元的内在电气性质，如静息膜电位和动作电位发射模式。

另一方面，细胞外电生理学涉及测量多个细胞或更大面积的电活动。这种方法通常用于研究神经网络的整体活动和相互作用。多电极阵列（MEA）可同时从多个部位进行记录，从而深入了解网络层面的活动。

总之，细胞内电生理学和细胞外电生理学的区别在于记录电极相对于细胞膜的位置。细胞内记录提供有关单个细胞电气性质的信息，而细胞外记录则捕捉一组细胞集体活动的信息。这两种方法对于了解生物系统的功能都非常有价值。

电生理学的未来

在技术和方法不断进步的推动下，电生理学的未来充满了令人兴奋的可能性。随着电生理学数据集复杂性的增加，我们已经看到了数据分析和计算建模方面的进步需求。机器学习工具将很有可能在从大型数据集中提取有意义的见解方面发挥关键作用。微型化和无线设备的开发已经开始，并将继续实现对人体电活动的微创监测。

光遗传学是一种尖端技术，其依靠显微镜和光学技术，使用光来控制特定细胞（通常是神经元）的活动。这种方法涉及对神经元进行基因改造，以引入光敏蛋白通道。成功表达后，使用光照射细胞的特定区域，就能局部改变离子浓度，并在显微镜下实时观察其效果。¹

这种对细胞活动的洞察力和可见度为研究神经回路、大脑功能和神经系统疾病以及开发治疗干预措施提供了机会。4 总体而言，电生理学的未来为增进我们对生物系统的了解、诊断和治疗疾病带来了巨大希望。

测量电生理学响应的3D刺激反应图示例。为了实现针对性较强的激光刺激，将观察区域划分为网格，激光以伪随机顺序照射每个区域，从而避免相邻区域受到连续刺激。根据膜片钳记录或成像强度绘制刺激反应图。集成可选的压电物镜转盘可将反应图扩展到3D，在不同于成像平面的深度提供刺激。图像数据承蒙东京大学医学部Haruo Kasai疾病生物学和综合医学中心提供。由FLUOVIEW激光扫描显微镜拍摄。

电生理学的关键要点

归根结底，电生理学是我们了解生物体复杂性的重心，尤其是在神经科学和心脏领域。通过揭开细胞电活动的神秘面纱，研究人员可以深入了解神经交流、肌肉收缩和许多生理过程背后的基本机制。

从早期科学家（如Galvani）领导的开创性实验到今天的现代尖端技术，电生理学领域在合作与求知的推动下经历了非凡的创新。通过不断探索，我们可以更深入地了解为人体提供动力的电活动。

参考文献

1. Hardin, Jeff et al. Becker’s World of the Cell, 9th Global Edition. Pearson, 2016.

2. Molleman, Areles. Patch Clamping: An Introductory Guide to Patch Clamp Electrophysiology. John Wiley Sons, 2008.

3. Ahmadi, Shirin et al. “From Squid Giant Axon to Automated Patch-Clamp: Electrophysiology in Venom and Antivenom Research.” Frontiers, 2023.

4. Häusser, Michael. “Optogenetics - The Might of Light.” New England Journal of Medicine, 2021.

来源：什么是电生理学？ | 奥林巴斯生物显微镜

荧光激发和发射的基本原理

荧光染料是光敏化合物，能够吸收特定波长的光能，并转化为波长更长的光。因此，荧光染料是细胞和组织研究中常用的检测试剂。荧光染料特有的电子构型让其具有独特的特征性吸收光谱（常与激发类似）和发射光谱。这些吸收和发射光谱显示了荧光的相对强度，通常纵坐标为相对强度，横坐标为波长。对于已知的荧光染料，制造商会告知光源激发强度峰值的波长，以及荧光发射强度峰值的波长。对于这些荧光染料的激发和发射光谱图与曲线来说，了解其来源很重要。

如何确定荧光染料的发射光谱

确定特定荧光染料的发射光谱时，需要确定最大吸收波长（常等同于最大激发波长）并在该波长下激发该荧光染料。图1(a)中显示了一个典型荧光染料的吸收光谱，纵坐标为吸收的相对强度，横坐标为波长。然后，我们用一个单色器（一种仅允许窄光波段通过的装置）进行扫描，得到全范围发射波长下相对应的荧光发射强度值。图1(b)中显示了基于各波长下荧光相对强度的测量值绘制的发射光谱。确定特定荧光染料的激发光谱时，也采用了类似的方法，即在用一组连续的波长激发荧光基团的同时，监测不同波长下的最大荧光发射强度。确定最大荧光发射强度，并只允许最大荧光发射强度对应波长的发射光通过检测器。在各激发波长下（通常通过单色器）诱导激发，并测量作为波长函数的发射荧光强度。测量结果可绘制为如图1(a)所示的图形或曲线，描绘了全范围激发波长光谱相对应的荧光强度。

激发和发射光谱的观察结果

一组典型的激发和发射曲线或光谱可让我们得到多个观察结果。激发光谱的长波长端和发射光谱的短波长端之间通常会有一个重叠区域。在荧光显微镜中，激发和发射强度与波长的重叠区域（如图1(c)所示）必须通过选择适当的激发滤光片、分光镜（反射光荧光）和发射滤光片来消除。否则，激发光太亮会掩盖较弱的荧光发射光，从而显著降低标本的对比度。

斯托克斯定律

当电子从激发态进入基态时，会有振动能损失（这一现象的解释见“荧光的分子机理”）。因为波长与辐射能成反比()，能量损失使发射光谱较相应的激发光谱更长。这种现象被称为斯托克斯定律(Stokes’ Law)或斯托克斯位移，由George G. Stokes爵士在十九世纪中期发现。斯托克斯位移越大，就越容易分离激发光和发射光。为了获得最高的荧光强度，最好在荧光染料激发波长的峰值处进行激发，在发射波长的峰值处（或由观察者选择的其他波长下）进行检测。激发波长和发射波长的选择由合适的滤光片控制，从而可限制允许通过的波长。在确定整个光学系统的光谱效果时，要求进行额外的技术校正，需要考虑诸如玻璃的透射率和检测器的灵敏度对应不同波长的差异等因素。

图2显示了一个典型荧光染料的吸收-发射光谱图。请注意，这一典型荧光染料的吸收（常与纯化合物的激发曲线相似）和发射荧光强度曲线在形状上有些相似。此外，在激发曲线的长波长端和发射曲线的短波长端有部分重叠。

激发和发射波长的分离

激发和发射波长的分离可通过选择适当的滤光片阻止或放行光谱中的特定波长而实现，如图3所示。荧光照明器的设计是基于对激发光和发射光的控制，即在通向样本的（激发）光路和样本所产生的（发射）光路中插入可随时更换的滤光片。考虑到发射强度低的情况，选择的激发光源必须有足够的亮度，这样才能最大限度地检测到相对较弱的发射光，同时选择的荧光染料需要具备合适的吸收和发射效率。

荧光染料吸收激发光的效率称为分子消光系数。分子消光系数越大，给定波长范围内光吸收的可能性就越大（诱发荧光发射的前提条件之一）。发射光的产率称为量子产率，即发射的量子数（能量“包”）与吸收的量子数之比（许多商用荧光染料的产率在0.1和0.9之间）。量子产率低于1是能量通过非辐射路径（如热或者光化学反应），而不是通过荧光的再辐射路径损失能量的结果。表1中给出了一组特定荧光染料的荧光量子产率。请注意，有些荧光染料的量子产率似乎很低（苯），而其他则很高（荧光素和罗丹明-B）。

荧光染料的荧光量子产率

表1

光源的分子消光系数、量子产率和平均发光强度（固有亮度）以及荧光寿命（激发态的持续时间）都是影响荧光发射强度和可用性的重要因素。此外，荧光染料周围的局部环境是决定荧光发射特性的关键因素。环境中的溶剂粘度、离子浓度、pH值和疏水性等变量，对荧光强度和激发态的寿命都有着重要影响。

荧光的分子机理

另一种描绘荧光活性的方法是雅布隆斯基(Jablonski)图，如图4(a)所示。激发前，分子的电子构型通常处于基态下。吸收了激发光的一个光子后，电子可能在短短的几飞秒（10^-15秒）内获得更高的能量跃迁到振动激发态。

在大约万亿分之一秒（皮秒或10^-12秒）内，激发态电子可能会向周围环境中释放部分振动能，并返回到最低激发单重态。随后，电子可从最低激发单重态“弛豫”回到基态，同时发射荧光，如图4(a)所示。发射光的波长始终比激发光波长长（斯托克斯定律），而且只要激发光一直照射荧光标本，发射光就会持续存在。如果激发光停止，发射荧光也会消失。

有时，激发后的电子不会在振动效应下弛豫到最低的单重态，而是向激发三重态进行跃迁，然后再回到基态，在这个过程中，辐射的发射现象可明显延迟几秒或更多时间。这一现象是磷光的特征，如图4(b)所示。在某些情况下，激发后的电子可能会从三重态回到最低的激发单重态，然后再回到基态，随后发射荧光。这一作用的时间比通常的荧光略长（约一两微秒），称为延迟荧光（图4(c)）。在光漂白或存在重金属盐或其他化学物质等其他情况下，发射光可明显降低甚至完全消失。

褪色或光漂白

有些特定条件可影响受激发的荧光基团的再辐射，从而导致荧光强度下降。这种降低发射光强度的现象通常称为褪色或光漂白。有时会将褪色进一步细分为淬灭和漂白。漂白是荧光分子在分子氧存在下由于光强而发生的不可逆分解。淬灭也会导致荧光强度降低，且常由氧化剂的作用或存在重金属盐或卤素化合物而导致。

通常，淬灭是由于能量从激发态荧光基团转移到物理上接近的其他受体分子而形成的，也称为共振能量转移。这种特殊的现象已经成为一种更新技术的基础，这种技术用于测量远低于光学显微镜横向分辨率的距离。

漂白的发生导致了FRAP技术的形成，即荧光漂白后恢复技术。FRAP技术利用短脉冲激光漂白，从而可观察随后因荧光基团扩散到漂白区域中而引起的荧光恢复现象。

常用抗淬灭试剂的特性

表2

为了降低部分样本的褪色程度，建议在光到达激发滤光片之前的光路中使用一个中性灰度滤光片，可以降低激发光的强度。在其他情况下，可改变封片剂的pH值或使用抗漂白剂（表2中列出了几种较为重要的试剂）可减轻褪色效应。在数字成像、显微成像或简单目视观察时，快速改变观察视野也可避免褪色效应。

什么是数字成像？

数字成像是一个用于描述图像的电子记录的广义术语。您几乎可以用数字方式捕捉任何图像——从日落风景到显微镜标本，再到扫描文档。

什么是数字图像？

数字图像是由一系列像素或图片元素组成。通过计算机读取图像文件并显示像素就可以在显示器上显示图像。

数字成像有何优点？

显微镜数字成像的四个核心优点：

• 永久记录：您可以在不降低图像质量的情况下无限复制同一幅数字图像。所以数字成像可帮助您保存科研载玻片并避免样品降解问题。

• 图像共享：数字图像可以通过电子方式发送给远方的同事，帮助您节约邮寄协作项目载玻片的运输费用。

• 图像调整：使用像cellSens成像软件这类用于显微镜的图像采集处理程序，您只需点击几下即可轻松处理原始数字图像，解决对比度不佳和噪点过多等问题。

• 定量分析：数字成像可以为定量图像分析提供数据，帮助您获得新的信息。比如说，您可以将数据与数据库中以前的成像结果进行比较。

如何提高显微镜的数字成像质量？

为了提高显微镜图像的质量，就要选择匹配您应用的光学器件和相机。

我们提供的在线资源可以帮助您找到供实验使用的显微镜物镜和相机。本博客就是一个很好的起点。更多指导信息，请参考我们的博客文章：如何选择合适的显微镜物镜：10个问题和选择合适显微镜相机的4种工具。

哪个显微数码相机功能参数最为重要？

影响图像质量的因素有很多。通常来说，可以先从相机分辨率和灵敏度开始。灵敏度是指相机传感器检测来自样品光线的能力。分辨率是指相机可捕获的细节程度。但正如我们之前提到的，这些功能必须要与您的光学器件、系统和应用保持一致。

举个例子：高分辨率的相机与低数值孔径的物镜并不搭配，因为其无法恢复经光学元件损失的样品结构信息。原因在于光分布的距离超过了相机的像素间距。在这种情况下，较低分辨率的相机将更适配较低数值孔径的物镜。

再比如，您需要在700~900nm波长范围内观察。那么选择能够感知该波长范围的相机非常重要。

另外还有许多其他因素需要考虑，因此请务必阅读我们的白皮书：选择显微镜相机时应当考虑的因素。

我们应该选择哪种类型的显微镜相机传感器？

几种类型的相机传感器各有优缺点：

• CCD是电荷耦合器件的首字母缩写。简而言之，CCD是具有光敏区域并作为数码相机传感器使用的半导体芯片。CCD传感器捕获光子并将其转换为电荷，而电荷则是用于成像的数字像素数据。传统上看，CCD传感器是科学研究应用的最佳选择。但是随着新传感器技术的出现，这种较为老旧的技术正逐渐风光不再。

• EMCCD代表电子倍增电荷耦合器件。EMCCD是一种可以将高于CCD读取噪声的弱光信号放大的CCD传感器。在传统CCD中，极低的信号水平通常低于传感器的读取噪声，因此其成像能力在以快速帧率捕捉极低光照水平下图像的应用中受到限制。
  EMCCD相机以检测弱光而著称，所以您可能有时候听见有人将其称为弱光相机。由于具有较高灵敏度，它因此成为在极弱光线下捕捉快速生物现象的有效工具。

• CMOS即互补金属氧化物半导体，也是CCD技术的后继产品。CMOS和CCD之间的首要区别是信号电子的读取架构。
  由于为单光敏二极管提供多读出放大器，CMOS的读取速度明显快于CCD。快速读取的弊端在于卷帘快门失真。由于CMOS快速扫描整个图像以收集数据，而非每次捕捉一个像素，因此曝光时间差有时会导致失真。
  相比之下，CCD传感器可以通过在存储电荷同时收集入射光子避免这种失真，从而让其能够同时读出每个像素。
  传统上，CMOS的信噪比低于CCD，但现在已经推出很多高质量的CMOS相机。另外，全局快门CMOS的引入解决了卷帘快门失真问题。

• sCMOS是科研级互补金属氧化物半导体的缩写，通常也缩写为科研级CMOS。 sCMOS是一种具有大尺寸像素和低噪声性能的CMOS传感器。其具备比常规CMOS更高的灵敏度。通常我们会像冷却CCD传感器一样，通过对sCMOS进行冷却来最大限度减少暗电流，以此获得更高的信噪比。
  sCMOS和EMCCD相机之间最重要的区别是sCMOS相机不具备长时间曝光的能力。对于需要长时间曝光或具有弱荧光信号的生物发光成像应用，EMCCD相机是首选，而sCMOS相机由于其能够与多种成像技术配合使用而广受欢迎。

来源于：蔡司官网

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光学显微镜：单目、双目、三目之间的区别

关于徕卡单目显微镜、徕卡双目显微镜、徕卡三目显微镜之间的区别主要是目镜的个数不同。

单目显微镜只有一个目镜，只能用一个眼睛进行观察，是单光路通道。双目显微镜有两个目镜，可以双眼同时观察，是双通道光路。三目显微镜除了可用双眼来观察两目外，还有一目是用来外接电脑和数码相机的。可以通过外接电脑或者数码相机对物体进行观察、记录。

市面上常见的是双目显微镜和三目显微镜。三目显微镜又是双目显微镜的延伸、扩展。三目显微镜在内部设计分光棱镜或者多组棱镜配置的时候，可将显微镜光线通过设计分别输出双目和第三目。三目显微镜在于能达到显微镜链接电脑或者相机进行拍照，图像处理，遥控显微镜操作等功能。