有助呈现生物样本的未染色透明结构

相差是一种光学显微镜技术，用于增加未染色样本的对比度。未染色样本的结构，例如活细胞或其细胞器，在明场照明下观察时可能显得模糊，甚至变得透明。若使用相差显微镜观察相同的样本和结构，就能以更高的对比度和更丰富的细节，清楚呈现这些样本和结构。

利用相移进行成像

由于人眼或光电传感器仅能观察到光波振幅（即强度）或波长（即颜色）的变化，因此对样本进行染色可以诱导振幅变化，导致光线穿过样本后在强度和/或颜色上出现差异^[1]。会引起光波振幅变化的样本或其结构称为振幅物体^[1]。染色剂非常有用，因为它们可以针对样本中的特定结构染色，不过它们可能导致活细胞中毒。

相差显微镜能够利用光路长度差异引起相移，从而视觉呈现原本难以观察到的模糊样本结构^[1]。它借助新形成光波的干涉将相移转化为振幅偏移。在光线穿过时会引起相移的样本或其结构称为相位物体^[1]。

相差显微镜技术诞生于1930年代，由荷兰物理学家弗里茨·泽尼克发明^[1-3]。1942年，这种技术投入实际应用，而泽尼克本人也于1953年获得诺贝尔物理奖^[4]。

图1：利用相差技术和明场照明拍摄到的犬肾细胞（MDCK）图像。

图2：利用相差技术和明场照明拍摄到的单细胞生物变形虫变形杆菌图像

光波干涉

光路长度（OPL）是介质的折射率（n）与光线在介质中两点之间传播距离（d）的乘积。OPL = nd。光路可能需要光线穿过多种介质，例如气体、液体或固体。常见示例包括光线从空气进入水中，或者从空气进入玻璃。光路长度与光线的传输时间和速度有关。光路长度的差异导致光波穿过样本的速度不同，即相移。因此，相位存在差异。与周围介质相比，较高的折射率会导致光波减速并降低相位。

干涉描述了两道光波之间的相互作用，并按照叠加原则形成新的波形。光波干涉的相关参数是它们的振幅。如果两道波相互干涉，生成光波的振幅等于每个干涉光波振幅的矢量和。

如果形成光波的振幅增大，这种干涉可以描述为相长干涉（构造性）。只要两者的波峰和波谷在同一个时间点相遇，就会出现这种情况。也有可能，一道光波的波峰与另一道的波谷在同一个时间点相遇。这种情况会导致形成振幅较低的光波。这两道光波之间的干涉称为相消干涉（破坏性）。

相差显微镜中的光路

相关显微镜的关键元件是环形光圈和相位板。环形光圈位于聚光镜的前焦平面内，限制了光波穿透的角度。相位板位于物镜的后焦平面内，搭配相差环，其材料可以按照λ/4的幅度调暗穿过相位板的光线，其中λ代表光线的波长。

在采用科勒照明的相差显微镜^[5]中，不与样本相互作用的光波在物镜的后焦平面上聚焦为明亮的光环。光环沿光轴方向上与相差环形成空间匹配，引发未偏离光的相移。样本衍射产生的光线并不完全照射在相差环上，因此不受影响。

受影响和未受影响的光波之间，最高可以形成λ/2的总相移。未偏斜光的相位在相差环处会提前λ/4，穿过生物样本时的衍射或散射光波通常会延后λ/4。λ/2的总相移会令光波在图像平面内产生相消干涉。为了增强对比度，未偏斜光在穿过相差环时会变暗并且有一部分光线会被相差环吸收。一定要避免未偏斜光比偏斜光更加明亮的情况，因为那会降低对比度。

相差显微镜中观察到的λ/2相移会产生最大程度的相消干涉效应，因为光波的波峰和波谷在同一时间点重合。因此，生成光波的振幅会减少，相位物体的相移转换为振幅偏移。

图3：相差显微镜中的光路穿过聚光镜环的环形光线通过聚光镜聚焦在样本上。部分环形光线被样本的光学致密结构（例如细胞膜、细胞器等）衍射，出现大约¼λ（通常适用于生物样本）的相移。这种相移和衍射光会绕过相差环，因此几乎不受相差环（通常位于物镜的后焦平面内）的影响。相反，来自聚光镜环的直射环形光线会直接到达相差环，后者会调暗直射光并引起相移（通常提前¼λ或延迟¾λ，以获得正相差）。由于样本折射光线与穿过相差环的光线之间存在高达½λ的总相移，因此会产生相消干涉。所以，光学致密结构会显得更暗（正相差）

图4：相差环是相差显微镜的核心部件。通常它由灰色滤光片和保留板组成。穿过样本且未发生衍射的光线部分穿过相差环（左箭头）灰色滤光片会让光线变暗以避免辐射。保留板会延迟非衍射光的相位，以便与穿过样本时发生衍射并经历相移的光波形成干涉（右箭头）

正相差和负相差——两种形式的相差

相差分为两种形式：正相差和负相差两者的主要区别在于使用的相位板。对于正相差，穿过相差环的光线相比偏斜光会增加，对于负相差，相位会减少。负相差中的相位延迟会产生相位差异，导致光波受到破坏。光波存在相位，并引发相长干涉，而非相消干涉，导致生成的光波振幅增加。

在正相差显微镜中，折射率高于周围介质的对象比折射率较低的对象显得更暗。在负相差显微镜中，情况完全相反。

解读相差图像

相差显微镜可以视觉呈现光线穿过样本时的光路长度差异。光路长度与样本的厚度和折射率有关。细胞膜和细胞器等细胞结构对于光路长度具有深远的影响。由于许多细胞（特别是细胞培养液中）具有扁平且规则的形状，因此使用明场显微镜几乎无法看到它们。

这种细胞相差图像可以放大细胞结构的差异，可以视为光致密图，因为光密度对于样本或样品的折射率有很大影响。不过，多种效应会导致相差图像的正确解释变得复杂，因为它们不直接取决于光路长度的差异。

光晕效应可以描述大型相位物体周边出现的正相差亮边或负相差暗边。光晕会形成是因为来自样本的部分衍射光会穿过相差环。未偏振波形成的光环要比相差环小一点，因此来自样本的低空衍射光波可以穿过相差环。穿过相差环的偏斜光保持着90°的相差，因此不受干涉的影响。这会导致对比度反转，导致大型物体的边缘出现光晕。

遮光效应是指样本的均匀部分和周围介质一样，以相同的光强度来显示所发生的情况虽然穿过这些区域的光线会发生相移，但只有轻微的衍射，且散射角度大幅降低。因此，这些光波进入相差环时，就像未偏斜光一样，不会发生干涉。

相差显微镜的另一个问题就是可能发生对比度反转。如果折射率很高的物体旁边是折射率较低的物体，它们就会显得更加明亮，而不是更暗（正相差的原因）。在这些区域，相移不是生物样本常见的λ/4，因此会出现相长干涉，而不是相消干涉（这与负相差正好相反）。

虽然这些效应会让相差图像在解读时更加困难，但相差显微镜是一种简单且重要的光学对比成像技术，可以对相位物体成像。此外，相差显微镜能够研究活体样本中的细胞功能和结构，因此是生物学研究中最为常用的光学对比法。

图5：曲霉菌的相差图像

图6：大鼠睾丸的相差图像

参考文献：（上下滑动查看更多）

1.E. Hecht, Optics, 5 Ed., Ch. 13 Modern Optics: Lasers and Other Topics, Sec. 13.2.4 Phase Contrast (Pearson, 2017), ISBN13: 9781292096933. www.pearson.ch/HigherEducation/PhysicsAstronomy/AdvancedPhysicsOptics/EAN/9781292096933/Optics-Global-Edition

2.F. Zernike, Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects, Physica (1942) vol. 9, iss. 7, pp. 686-698, DOI: 10.1016/S0031-8914(42)80035-3.X. www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S003189144280035X

F. Zernike, Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects part II, Physica (1942) vol. 9, iss. 7, pp. 686-698, IN1, 981-982, IN3, 983-986, DOI: 10.1016/S0031-8914(42)80079-8. www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0031891442800798

4.F. Zernike, Nobel Lecture, Nobel Prize in Physics 1953, Nobel Prize Organization (2023). www.nobelprize.org/uploads/2018/06/zernike-lecture.pdf

5.M. Wilson, Koehler Illumination: A Brief History and a Practical Set Up in F

来源于徕卡显微系统微信公众号

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汽车工业现在会通过一系列装饰或功能性处理改善车身表面。然而，用于检测多层样本的传统质控方法不仅耗时，而且还会漏检缺陷。结定位表面研磨系统和光学显微镜的新方法有望提高检测的速度和可靠性。

安美特西班牙实验室经理F. Javier Ruiz Balbas讲述了自己使用这一系统的体验。安美特是一家全球领先的供应商，专为印刷电路板、先进包装和半导体制造以及装饰性和功能性表面处理提供特种化学药品、设备、服务和解决方案。

您能简单介绍下质控部门的工作流程吗？

您工作中的主要挑战是什么？

随着新材料的发展，汽车工业中对质控的要求有哪些变化？

您公司的质控部门有哪些独特的优势呢？

在使用徕卡EM TXP/DM2700 M系统之前，工作流程是怎样的？有哪些不足之处？

您在日常工作中已经积累了一些操作徕卡EM TXP/DM2700 M的经验，那么您对它有什么概括性的总结呢？系统的哪些优势对您的质控工作帮助最大？

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正确的清洁度分析解决方案对质量控制至关重要。本文介绍了选择适合自身需求的解决方案时应考虑的一些重要因素。这些因素取决于不同的方面，例如行业（微电子或汽车）、污染物类型、尺寸、成分、材料属性和可能造成的损害等。

从基本的清洁度验证到更复杂的分析，有多种基于显微镜和激光光谱的清洁度解决方案可供选择。

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介 绍

汽车零部件和电子元件中的微粒子污染会对产品性能和使用寿命产生严重的影响^[1-3]。如果关键部件受到重度污染，车辆或设备系统就会出现重大故障。因此，对于现代制造和生产中的质量保证，清洁度分析在确定颗粒物尺寸和材料属性方面具有重要的作用。为帮助用户选择适合自己需求的正确清洁度分析解决方案，下文列出了一些需要考虑的主要因素。

“

需要考虑的因素

为找到最适合用户需求的清洁度分析解决方案，可以先思考下面的几个问题。

主要应用是什么？

清洁度分析是否会影响组件和零部件的生产与组装，例如汽车和电子行业？如果是，那么这两个行业对颗粒物污染有着严格的要求，包括类型、大小、成分和可能造成的损害等，通常要按照ISO 16232、VDA 19或ZVEI（电子工程技术清洁度）等标准和指南执行分析^[2,4]。或者清洁度分析是针对液压流体、润滑剂、燃油和医药产品？对大多数机械系统而言，需按照ISO 4406和DIN 51455标准来对液压流体、润滑剂和燃油执行清洁度分析^[5]。医药产品清洁度分析通常遵循USP 788标准。由于不同应用的清洁度分析存在重大的差异，选择的解决方案需要能够准确可靠地确定颗粒物分析所要求的各项参数。

图1：示例A)汽车零部件和组件，和B)印刷电路板(PCB)，清洁度分析在质量控制和生产中可以发挥重要的作用。

要分析的颗粒物的尺寸是多大？

在汽车行业中，大颗粒物(>25 µm)和坚硬的颗粒物（陶瓷和金属）由于其磨损性质可能会造成严重的损害。但对于亚微米级的电子元件，即使是较小的颗粒物（5到10µm或更小）也会造成问题。对于流体清洁度，需要分析5µm或更大的颗粒物。选择清洁度分析解决方案时，了解要分析的颗粒物的尺寸非常重要。

图2：清洁度分析中的滤膜里污染物的图片，显示了不同尺寸的颗粒物。

应用需要区分反光颗粒物和非反光颗粒物吗？

反光颗粒物，即导电性颗粒物，通常为金属，相比非导电性颗粒物，通常为非金属，可对汽车零部件和电子元件造成更大的损害。因此，在确定颗粒物可能造成的潜在损害时，如果能够区分反光和非反光颗粒物，会大有帮助。如果清洁度分析解决方案能够帮助用户有效区分反光颗粒物和非反光颗粒物，用户便可以更好地确定颗粒物可能造成的损害。

确定颗粒物材料重要吗？

如果清洁度分析的最终目标是找到并清除污染物来源，则了解颗粒物的成分便十分有用。在这种情况下，理想的解决方案应能够帮助用户高效可靠地识别颗粒物材料。

图3：使用光学显微镜和激光光谱确定的铝合金颗粒物的成分。

来源：徕卡显微系统 https://mp.weixin.qq.com/s/iJ3mZ8KS3LLKLQ1Y315olg

DIC显微镜

大多数人在使用显微镜时都采用明场照明。遗憾的是，对很多生物标本来说，明场显微镜通常只提供低对比度图像，在其中几乎无法辨别任何细节。使用染色剂可以增加明场的对比度，但这也有一个风险，即染色剂可能对活细胞有毒。在DIC显微镜中，DIC指的是微分干涉对比法，与明场显微镜相比，其无需染色剂也可以更大的对比度观察多种生物标本的结构。这种光学对比法主要是利用偏振光和样本的厚度或光密度差异，这种差异会导致通过样本的光发生相移。
只有特定的徕卡显微镜具备DIC。其可用于观察各种生命科学或法医学应用中的细胞或组织。DIC显微镜也可用于某些材料和地球科学应用。

什么是DIC显微镜，它的作用是什么?

DIC是微分干涉对比法，这是一种显微镜光学对比技术，通过其可以获得充足的对比度和分辨率，从而观察到未染色的生物标本的细胞结构。它也能帮助观察材料表面上小的高度差异。只用偏振光照亮样本时，偏振光被分散成两束具有正交偏振平面的不同光线。当光线在样本中经过不同的折射或散射后，会出现不同的相移。这些光线再次汇聚时，它们会相互干扰并变成椭圆偏振光。这种偏振光通过分析仪时会变为振幅偏移。在DIC图像中，可以观察到差异小于1/1000个波长的相移（当用相机传感器检测时）。DIC显微图像呈浮雕状，看上去有阴影。

如何设置DIC显微镜？

DIC显微镜是一种宽视场显微镜，在光源镜与聚光镜之间，以及在物镜和相机传感器或目镜之间，都设有偏振滤光器和沃拉斯顿棱镜。如需更多DIC显微镜设置信息，请参阅文章： 微分干涉对比（DIC）与金相学

微分干涉对比（DIC）显微镜是如何工作的？

DIC显微镜是一种使用偏振滤光器和沃拉斯顿棱镜的传统宽视场显微镜。

光源散发出的光会穿过滤光器，变成45°的偏振光。在穿过沃拉斯顿棱镜后，光会被分成垂直偏振分量，其中一个为0°偏振，另一个为90°偏振。聚光镜将光聚集在标本上，再由2束偏振角度不同的连贯平行光线照射到标本上。光线穿过不同的光路长度，因为其穿过样本的路径上可能存在厚度或折射率差异。
最后的结果是，一条光线相对于另一条光线出现相移。垂直偏振光通过物镜和另一个沃拉斯顿棱镜后，重新组合成135°偏振光。根据光路长度的不同，这两束光线的干扰会产生建设性（增亮）或破坏性（变暗）干扰，使得原本用明场显微镜几乎观察不到的结构现在可通过DIC显微镜观察到。
最后，偏振滤光器（也称为分析仪）会将未发生任何相移的直接透射光滤除，其只允许135°的偏振光通过。如需了解详细信息，请参阅文章： 微分干涉对比（DIC）

来源：DIC显微镜 | 产品 | 徕卡显微系统 (leica-microsystems.com.cn)

本报告简要讨论了几种常用于评估表面形貌（也称表面结构或表面光洁度）的重要计量方法和标准定义。随着纳米技术、薄涂层以及电路和装置小型化的出现，表面计量学已经成为一个极其重要的科学和工程领域。其从微米级和亚微米级特征的角度研究表面形貌的精确、代表性表征。这些特征构成了表面的波纹度、粗糙度和层次。形貌在确定许多现代技术、组件、部件和产品（例如电机、涂层、电子设备等）所用材料的机械、热、光学和电气性能方面起着至关重要的作用。

表面表征的光学方法可以具有高垂直（z）分辨率，但不如探针方法或电子显微镜的横向（xy）分辨率。但是形貌采集要快得多。这意味着光学方法可提供大面积的表面形貌数据，使其更适用于可靠、准确的统计分析。

SEM也可获得非常高的分辨率，但需要在真空室中进行成像。如果材料的导电性不够，则在电子束中会发生充电，因此样品必须涂一层导电膜。采集图像通常会很耗时。

来源:徕卡显微系统

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细胞培养

取您所需，利用徕卡显微系统的细胞和组织培养倒置显微镜提高活细胞成像工作流程中的效率。

这些使用简便的显微镜允许您根据自身需求配置相应的成像解决方案，可搭载灵活多样的聚光镜选件和数字成像记录功能，从未为您的实验室打造恰到好处的解决方案。

徕卡细胞培养显微镜系统特性：

操作简便，所需的培训和维护量极小，以便您将精力都集中在研究工作上

冷光源 LED 照明在所有光亮度级别下提供恒定的色温

简易荧光装置 (选配) 可轻松呈现您的荧光标记

高清成像 (选配) - 将高清摄像头直接连接到显示器或 PC；提供高质量的可发表图像

灵活的工作距离，最高可达 80 mm，可容纳载玻片、petri 培养皿、多孔板和较高的培养瓶

细胞工厂解决方案可容纳最高 400 mm 的器皿

细胞分类

细胞外形

实验室培育的动物细胞可根据多项标准进行区分：

显微镜下可以轻松地识别其形态。成纤维样细胞为双极或多极细长形状，而上皮样细胞呈多边形。与上面两种细胞不同的是，淋巴母细胞样细胞并非贴壁生长，而是悬浮生长。

细胞的类型可细分为永生细胞、原代细胞和干细胞。

细胞组织形式可谓丰富多样，从简单的二维单层培养细胞到二维共培养细胞，再到三维球状细胞团和类器官

将细胞系用于细胞培养的一些实例。

细胞培养材料

如何培养细胞

动物细胞在各类不同的器皿中培养，涵盖用于基础研究的小型微流体装置、用于筛选目的的 96 孔板乃至用于大规模药物生产的细胞培养瓶和细胞工厂。

鉴于其一次性使用特点，多数容器使用塑料制成。其它器皿则专为显微镜应用优化设计，因此具有玻璃底。

动物细胞培养基包含：

• 水

• 能量来源

• 氨基酸

• 维生素

• 以及盐类

此外，它还包含缓冲系统和 pH 值指示剂，用于检查 pH 值是否平衡。

细胞培养维护

您的日常工作内容是什么？

由于细胞会消耗培养基中的成分，必须定期补充培养基。在这种情况下，细胞培养过程中应进行目视检查，以观察汇合程度和健康度并检测潜在的微生物污染。

永生细胞系的一个特征就是无限增殖。因此，它们必须时不时进行分裂 (传代) 并转移至单独的培养器皿中。

通常，培养的细胞在用于实验前就进行了基因改造。例如，借助 转染操作，研究人员为所需要的蛋白质添加 荧光标记 ，以便通过显微镜将其可视化。

MDCK cells in different confluence stadiums.

显微镜 – 基本要求

我需要哪种工具？

为管理细胞培养实验室的日常工作，显微镜是一件必需品。此类显微镜必须具备倒置配置。倒置显微镜采用“物镜位于样品下方，聚光镜位于样品上方”的设计，这样就能使物镜尽量贴近细胞，并在上方保持较大的工作距离。

由于动物细胞的固有反差极低，细胞培养显微镜必须提供诸如相差等反差观察法。DIC (微分干涉相差) 在这里无法发挥作用，因为该技术无法配合塑料器皿用于细胞培养。DIC 有一个很好的替代方案，那就是 IMC (整合调制相差)，该技术不仅能搭配塑料容器使用，而且无需借助专用物镜或棱镜。此外，细胞培养显微镜应易于操控，以避免浪费时间。

徕卡细胞培养显微镜具备出色的易用性，并可针对个性化需求提供灵活多样的反差观察方法。

显微镜 – 高级要求

我需要哪种工具？

一种很常见的细胞生物学科研手段是使用荧光标记转染细胞，以便使用研究型显微镜进行后续研究。如果您使用荧光蛋白，您的细胞培养显微镜还需要配备荧光选件，以用于控制转染效率。

为实现重要的记录和标准化目的，显微镜应配备数字摄像头，最好能够记录和梳理拍摄的数据。

由于细胞培养实验室都存在空间问题，细胞培养显微镜的尺寸不宜过大，例如，最好能安装在超净台中。此外，最新趋势都要求显微镜设计得足够小巧和稳固，以便在培养箱内部使用。

用于大批量生产应用的显微镜

生产生物材料 (例如蛋白质、疫苗或抗体) 需要在大型器皿中培养细胞。

为应对这一要求，相关的细胞培养显微镜必须具备较大的工作距离和视场。此外，它需要具备极高的稳定性，以便牢固地承载大型器皿乃至大量器皿。

Leica DM IL LED 可使用超长透射光照明臂进行配置，以便您自由调节细胞培养器皿所需要的工作距离，高度最高可达 40 cm。

细胞检测

活细胞应用

细胞培养是一个动态过程。与其它任何生物系统一样，细胞的生长和行为有时难以预测。因此，长期监测比仅仅在单个时间点检查细胞培养过程更具优势。

而这正是显微镜能够一展所长的地方，您可将其放置在培养箱中，以便全天候不间断地监测细胞。例如，借助这一特性，您可随时随地检查细胞培养的汇合程度。